楊銘　王勇　段金良

[摘要]目的：探討程序冷凍法冷凍精子在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中的臨床結(jié)局及安全性。方法：回顧分析在本中心進(jìn)行IVF-ET治療的不孕夫婦的372個周期，分為4個組：用程序冷凍法冷凍精子行常規(guī)IVF共76個周期（A組），程序冷凍法冷凍精子行ICSI共92個周期（B組），同期新鮮精液行常規(guī)IVF周期97例（C組），新鮮精液行ICSI周期107例（D組），分別比較A組與C組、B組與D組的正常受精率、異常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率和畸形率。結(jié)果：與新鮮精液IVF-ET組相比較，程序冷凍法冷凍精子常規(guī)IVF組及ICSI組的正常受精率、異常受精率、卵裂率、妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率和畸形率等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）：但冷凍精子行ICSI組與新鮮精子行ICSI比較，優(yōu)質(zhì)胚胎率低且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：用程序冷凍法冷凍精子助孕可以獲得與新鮮精子相似的結(jié)局，是一種較為安全可靠的精液保存方法，可用于IVF—ET術(shù)前精液冷凍保存。

[關(guān)鍵詞]程序冷凍法；精子冷凍；體外受精-胚胎移植

[中圖分類號]11697 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

精子冷凍作為一種常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于不孕癥的治療當(dāng)中。精液的預(yù)先冷凍可以減少取精困難的患者取卵日當(dāng)天的取精壓力，為取卵日當(dāng)天因為特殊原因無法來醫(yī)院取精的男性患者提供方便，同時也可以保存患者在經(jīng)皮副睪穿刺取精（PESA）或睪丸穿刺取精（TESA）手術(shù)中獲得的精子，亦可以對有需要的患者（接觸毒物、放射性及癌癥放化療等）進(jìn)行生育率保存。如何提高精子冷凍技術(shù)水平、減少精子冷凍損傷與保持冷凍精子的正常功能是我們在工作中值得關(guān)注的問題。而程序冷凍法是目前精子冷凍中較為常用的方法之一。本文回顧性分析了2009年1月至2013年10月在本中心進(jìn)行體外受精一胚胎移植（IVF-ET）的372個周期，探討程序冷凍法冷凍精子對IVF和ICSI臨床效果和安全性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

隨機(jī)選取2009年1月至2013年10月在我院生殖中心進(jìn)行不孕癥治療的患者共計372個周期，排除夫婦雙方染色體異常、女方卵巢反應(yīng)不良、子宮內(nèi)膜異位癥。根據(jù)是否冷凍和受精方式不同分為四組：用程序化冷凍法冷凍的夫精行常規(guī)1VF治療76個周期（A組）；用程序化冷凍法冷凍的夫精行ICSI治療的共92個周期（B組）；同期用鮮精常規(guī)行IVF-ET的97個周期（C組）；用鮮精常規(guī)行ICSI的107個周期（D組）。ICSI指證是：（1）嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥；（2）既往體外受精-胚胎移植周期（IVF-ET）受精率低（<30%）；（3）精子頂體反應(yīng)異常?；颊咴谖抑行倪M(jìn)行精子冷凍保存并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 精液冷凍 男方清潔雙手后，手淫取精，將精液留取于無菌容器內(nèi)。精液液化后用梯度離心法300g×15min離心，吸取離心管底部精子沉淀，加入3mL ART-1006精子洗滌液（Quinn s，美國），200g×10min離心洗滌2次，留取精子沉淀0.2mL，緩慢添加精子冷凍液ART-8020（SAGE，美國）1：1，邊滴邊攪拌，將充分混勻的精子分裝入麥管中，放入程序冷凍儀CL-8800（CRYOLOGIC，澳大利亞）中運(yùn)行冷凍程序，完成冷凍后放入液氮中冷凍保存。

1.2.2 精液解凍 采用快速復(fù)溫法，從液氮罐中取出裝有冷凍精液的麥管，直接放入37℃水中復(fù)溫10min，加入3mL ART-1006精子洗滌液（Quinn s，美國），200g×10min離心洗滌2次，體外獲能2h后，行常規(guī)IVF或ICSI。

1.2.3 促排卯方案及卵子收集 選擇有助孕指征的患者，根據(jù)患者的情況選擇常規(guī)的長方案、短方案或為微刺激方案超排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡≥18mm或2個主導(dǎo)卵泡≥17mm時，當(dāng)晚肌注hCG（麗珠）10000IU后36h在B超下經(jīng)陰道取卵，在體視顯微鏡下檢出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs），于5%SPS的揀卵液反復(fù)沖洗后，放入含10%SPS的受精液中37℃、5%C02和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后備用。

1.2.4 受精方法 根據(jù)男方精液情況選擇行常規(guī)IVF或ICSI。常規(guī)IVF：取卵后將卵子放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6h，按每個卵子10萬條的比例加入洗滌好備用的精子進(jìn)行體外受精。ICSI：取卵后將卵子放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6h，選取MⅡ期卵子注射之前準(zhǔn)備好的精子。

1.2.5 受精、卵裂、胚胎觀察和妊娠診斷 受精后16～20 h后觀察卵子受精情況，取卵后第2d或第5d進(jìn)行胚胎觀察與移植，移植胚胎數(shù)不超過3個。移植2周后，檢驗血hCG了解是否妊娠，第35d行超聲檢查，見到孕囊并有心管搏動為臨床妊娠。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗分析，率的比較采用x²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究對268個周期的程序法冷凍精子進(jìn)行了回顧性分析，比較了程序法冷凍的精子與新鮮精子行常規(guī)IVF及ICSI的臨床效果，結(jié)果顯示各組患者年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

與新鮮精子IVF組相比較，冷凍精子IVF組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率、畸形率等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但冷凍精子IVF組受精率低于新鮮精子IVF組且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

冷凍精子ICSI組受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率、畸形率等方面與新鮮精子ICSI組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但優(yōu)質(zhì)胚胎率低于新鮮精子ICSI組且有統(tǒng)計學(xué)意義，（P<0.05）。見表3。

3 討論

精子的冷凍保存是指在超低溫的環(huán)境下（-196℃）維持精子活性的方法。精子的冷凍技術(shù)經(jīng)過200多年的不斷發(fā)展和完善，目前已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)中的重要組成部分。冷凍精子應(yīng)用的領(lǐng)域主要有：（1）幫助放化療患者、日常接觸有毒有害物質(zhì)工作及將要進(jìn)行結(jié)扎術(shù)的男性保存其生育力。（2）在輔助生殖治療中，提前冷凍可能在取卵日取精失敗的患者的精子，待取卵日解凍。冷凍無精癥患者通過活檢穿刺取得精子，避免下次取精失敗。（3）建立人類精子庫，為患有無精癥或嚴(yán)重遺傳病的不孕夫婦提供健康精子進(jìn)行供精人工受精或供精體外受精治療。

人類精子經(jīng)過和冷凍保護(hù)劑的混合、冷凍降溫、超低溫儲存和解凍復(fù)溫等過程，受到物理化學(xué)等一些列效應(yīng)作用，使精子功能不可避免的受到影響。程序冷凍法是目前精液冷凍中比較成熟的一種冷凍方法。通過程序化冷凍儀預(yù)先設(shè)定的程序可以使精子在一個恒定的速度下分步降溫：將處理好的精子加入冷凍保護(hù)劑中，放入程序冷凍儀中，通過泵入的液氮蒸氣，先以-1.5℃/min后以-6℃/min，從-20℃降到-80℃，最后投入到-196℃的液氮中保存。這種方法的優(yōu)點(diǎn)使精子細(xì)胞逐步適應(yīng)低溫環(huán)境，較為穩(wěn)定，可減少冷休克的發(fā)生，減少了人為因素的影響，缺點(diǎn)是耗時較長。

本中心從2009年開始采用程序化冷凍法冷凍精子，冷凍精子原因主要是由于IVF術(shù)前部分男性患者為預(yù)防取卵日取精困難或男方外出無法取精等原因無法取得精液。研究顯示冷凍精子行常規(guī)IVF組的受精率低于新鮮精子行常規(guī)IVF組，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這可能與精子在冷凍時容易受到冷凍損傷有關(guān)。降溫過程中細(xì)胞損傷有兩個機(jī)制，一是“胞內(nèi)冰晶損傷”，表現(xiàn)為胞內(nèi)生成冰晶，如果冰晶逐漸變大，細(xì)胞骨架和細(xì)胞器都會受到擠壓，對細(xì)胞造成不可逆的機(jī)械系損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一個是“溶質(zhì)性損傷”，表現(xiàn)為細(xì)胞外的水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度升高并持續(xù)較長時間，由高滲引起細(xì)胞損傷。受到冷凍損傷的精子，會出現(xiàn)如：超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、頂體結(jié)構(gòu)異常、精子細(xì)胞膜完整性破壞、線粒體功能的損傷、DNA完整性損傷，從而導(dǎo)致精子活動率降低，受精能力的下降。

本研究還顯示新鮮精子ICSI組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于冷凍精子ICSI，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與常規(guī)IVF相比，ICSI避免了精卵細(xì)胞結(jié)合的復(fù)雜受精過程，降低了對精子活力和授精能力的需求，成為男性因素不育患者主要的治療方法。冷凍精子行ICSI過程中，注射的精子的染色體在解凍中會受到一定的損傷。Seli等研究證實(shí)，DNA受損的精子雖然保持有成功受精的能力，但會影響受精后胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚胎在D3的評分中偏低，甚至發(fā)育停滯。結(jié)果提示ICSI作為一種侵入性的輔助治療手段，對胚胎的質(zhì)量有一定的不利影響。但臨床妊娠率卻未受到顯著影響，這說明了卵子和胚胎有著一定的DNA修復(fù)能力，可以修復(fù)部分受損害的配子。而胚胎修復(fù)精子DNA損傷能力的大小被認(rèn)為與卵母細(xì)胞的質(zhì)量和母系基因的完整性密切相關(guān)。

“試管嬰兒”出生結(jié)局一直引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，早期研究認(rèn)為IVF不增加后代先天畸形的危險性，近來研究顯示ART子代出生缺陷發(fā)生率增加。Klemetti等研究認(rèn)為，全球通過IVF出生的兒童出生缺陷發(fā)生率可能比自然妊娠出生的兒童出生缺陷率高大約25%～30%。有研究發(fā)現(xiàn)ART的單胎兒中早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量比自然妊娠更常見。但目前尚沒有強(qiáng)有力的證據(jù)證明解凍精子行ATR與用鮮精出生的子代結(jié)局有顯著差異。近年有研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生的男嬰存在出生缺陷的幾率加大，但冷凍精子ICSI是否會加劇這一缺陷的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。本研究中四組的流產(chǎn)率、多胎率及畸形率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），提示程序法冷凍精子是一種較為安全可靠的冷凍方法，這與Oehninger等的研究結(jié)果類似。但由于本資料樣本例數(shù)較少，今后對于出生結(jié)局情況的進(jìn)一步研究仍需長期大樣本資料的隨訪。

（收稿日期：2015-03-02）