婁秋莉，馬一鳴，車(chē)雪梅，鐘瑾，孫小霞，張浩千

1 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 3500022 藍(lán)晶 （北京） 生物科技有限公司，北京 1000843 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

工業(yè)生物技術(shù)

具有抗菌效應(yīng)的聚羥基脂肪酸酯生物塑料的制備與功能表征

婁秋莉1，馬一鳴2，車(chē)雪梅2，鐘瑾3，孫小霞1，張浩千2

1 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002
2 藍(lán)晶 （北京） 生物科技有限公司，北京 100084
3 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

婁秋莉， 馬一鳴， 車(chē)雪梅， 等. 具有抗菌效應(yīng)的聚羥基脂肪酸酯生物塑料的制備與功能表征. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016，32（8）: 1052-1059.

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聚羥基脂肪酸酯 （Polyhydroxyalkanoates， PHAs） 作為一類(lèi)新型的生物高分子材料，因其多樣的材料性質(zhì)與高度的生物可降解性日益受到關(guān)注。使用乳酸鏈球菌素 （Nisin），一種被公認(rèn)為安全的天然食品防腐劑，制備了具有高效、持久抗菌效應(yīng)的PHA塑料。首先采用溶劑澆鑄的方法將Nisin整合到正3-羥基丁酸-3羥基己酸共聚酯 （PHBHHx），一種具備高度生物相容性的PHA中，從而獲得了具有抗菌效應(yīng)的PHBHHx薄膜。激光共聚焦顯微鏡觀察表明Nisin在PHBHHx中呈顆粒狀均勻分布。隨后以條件致病菌藤黃微球菌Micrococcus luteus為測(cè)試菌株，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法，測(cè)定PHBHHx薄膜抗菌效應(yīng)對(duì)Nisin含量的依賴關(guān)系；在液體培養(yǎng)條件下測(cè)量PHBHHx薄膜的Nisin釋放效果與抗菌效應(yīng)。結(jié)果表明Nisin可從PHBHHx薄膜順利釋放且Nisin的含量高于25 μg/g時(shí)即表現(xiàn)出顯著的抑菌效果且可長(zhǎng)時(shí)間維持。該研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的PHA奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)，拓展了PHA在醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

聚羥基脂肪酸酯，乳酸鏈球菌素，抑菌塑料，藤黃微球菌

隨著石油資源的不斷消耗和石化產(chǎn)品尤其是不可降解的傳統(tǒng)塑料所造成的白色污染日益嚴(yán)重，可天然降解的綠色生物塑料正在受到越來(lái)越多的關(guān)注［1］。不同于生產(chǎn)過(guò)程仍需化工縮聚反應(yīng)的聚乳酸 （Polylactic acid，PLA），聚羥基脂肪酸酯 （Polyhydroxyalkanoates，PHAs） 作為1種新型的可降解生物塑料可由微生物利用可再生的生物質(zhì)原料進(jìn)行全程的發(fā)酵生產(chǎn)，其環(huán)境污染指數(shù)低，更為環(huán)保［2-3］。更為重要的是，PHA種類(lèi)繁多 （僅其單體就超過(guò)150種），化學(xué)性質(zhì)和材料性能差異極大，在不同的環(huán)境中均表現(xiàn)出很高的生物可降解性，其潛在的應(yīng)用前景因此更為廣泛［4-5］。特別是在醫(yī)療和食品領(lǐng)域，聚 （3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯）［6］和聚 （3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯） （Poly（3-hydroxybutyric acid-co-4-hydroxybutyric acid）， P（3HB-co-4HB））這兩種PHA因其極強(qiáng)的生物相容性和人體可植入性展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力，可用作手術(shù)縫合線、骨釘、人造骨骼、食品包裝等，其相關(guān)研究亟需展開(kāi)［7-9］。

乳酸鏈球菌素 （Nisin） 是由乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. lactis產(chǎn)生的一種陽(yáng)離子多肽，可以有效抑制多種引起食品腐敗和醫(yī)學(xué)感染的革蘭氏陽(yáng)性菌［10-11］，對(duì)沙門(mén)氏菌Salmonella等部分革蘭氏陰性菌同樣有抑制效果［12］。Nisin可被人體腸道分泌的α-胰凝乳蛋白酶有效降解，因此對(duì)人體安全無(wú)毒，是目前唯一大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的高效天然防腐劑［10，13］，被廣泛應(yīng)用于歐盟、中國(guó)、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的食品行業(yè)中［14-15］。特別值得注意的是，除了作為食品防腐劑之外Nisin亦可被應(yīng)用到多種材料中以達(dá)到抗菌效果。Qi等［16］利用PEG 1000 將Nisin穩(wěn)固結(jié)合到碳納米管上，從而使碳納米管具備了抗菌活性。Jin等［17］則將Nisin整合入聚乳酸 （PLA） 以生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的食品包裝袋。進(jìn)一步研究表明，在帶有Nisin-PLA涂層的牛奶灌裝瓶中，李斯特菌Listeria monocytogenes的生長(zhǎng)被顯著抑制，并且抑制效果在 4 ℃保存條件下可維持70 d［18］。

在本試驗(yàn)中，我們首先利用溶劑澆鑄的方法將Nisin整合入PHA （PHBHHx），從而獲得了具有抗菌效應(yīng)的PHBHHx薄膜；激光共聚焦顯微鏡的觀察表明Nisin在PHBHHx薄膜內(nèi)部呈顆粒狀均勻分布［19］；隨后的功能實(shí)驗(yàn)表明，僅僅25 μg/g的Nisin濃度就足以使得PHBHHx薄膜對(duì)于典型條件致病菌——藤黃微球菌Micrococcus luteus NCIB 8166的生長(zhǎng)起到顯著抑制，且抑制效果可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)。本試驗(yàn)成功使用乳酸鏈球菌素制備了具有高效、持久抗菌效應(yīng)的PHA塑料，并且通過(guò)詳細(xì)的功能表征與顯微鏡觀察，為PHA生物塑料在醫(yī)學(xué)與食品領(lǐng)域的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與試劑

用于抗菌效應(yīng)檢測(cè)的菌株為藤黃微球菌M icrococcus luteus NCIB 8166。培養(yǎng)基為SI培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30 ℃，靜置或 200 r/m in。PHBHHx塑料粉料由北京藍(lán)晶生物科技有限公司提供。乳酸鏈球菌素 （Nisin） 樣品由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供，純度為2.5%，剩余雜質(zhì)為無(wú)機(jī)鹽和蛋白粉。其余所需試劑均購(gòu)自Sigma-A ldrich公司。

1.1.2含有Nisin的PHBHHx塑料薄膜

選取二氯甲烷作為溶劑澆鑄的溶劑；這是因?yàn)槎燃淄榫邆浠瘜W(xué)惰性和高揮發(fā)性且已有工作表明PHA在二氯甲烷中可高效溶解［20］。稱(chēng)取不同質(zhì)量梯度的Nisin，各自加入一份溶解了1 g PHBHHx粉料的15 m L二氯甲烷中；Nisin樣品的用量分別是0.01、0.1、1、4、16、64和256 mg，換算為 Nisin純凈物則為 0.25 μg、2.5 μg、25 μg、100 μg、400 μg、1.6 mg和6.4 mg（后文中Nisin濃度與用量皆指純凈物）。用磁棒攪拌直至 Nisin樣品粉末完全分散到聚合物溶液中，將混勻的溶液澆鑄到9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，通風(fēng)櫥內(nèi)靜置24 h。待二氯甲烷完全揮發(fā)，PHBHHx成膜；塑料膜的厚度約1 mm，面積約為63.5 cm2，因此Nisin在薄膜中的分布濃度為（x×2.5%） μg/63.5 cm2即 （x×0.394） μg/cm2，x代表含有 Nisin的混合物樣品的質(zhì)量的數(shù)值 （以mg單位記）。用6 mm直徑的打孔器將塑料膜加工為圓形薄膜，保存在密閉容器中待用。

1.2方法

1.2.1利用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試PHBHHx-Nisin薄膜的抑菌效應(yīng)

將藤黃微球菌單克隆菌落接種到5 m L SI液體培養(yǎng)基中；30 ℃、200 r/m in條件下培養(yǎng)16 h，獲得種子液 （OD600=1.9）。取500 μL種子液加到50 m L SI固體培養(yǎng)基中，混勻以制備瓊脂擴(kuò)散法所需的平板，每個(gè)平板含有約25 m L的SI固體培養(yǎng)基。將6 mm直徑的 PHBHHx-Nisin圓形薄膜平放在 SI固體培養(yǎng)基表面，每種 Nisin含量的薄膜有6個(gè)重復(fù)，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；對(duì)照組為不含Nisin、等直徑的PHBHHx薄膜。用卡尺測(cè)量每個(gè)抑菌圈的大小并記錄。

1.2.2Nisin在PHBHHx薄膜中的物理分布

將直徑6 mm的PHBHHx-Nisin薄膜固定在載玻片上，Nisin的濃度分別為 100 μg/g和25 μg/g。PHBHHx-NaCl薄膜和PHBHHx薄膜分別作為對(duì)照組；PHBHHx-NaCl薄膜中的NaCl濃度為0.975 mg/g （與25 μg/g Nisin含量的膜片所對(duì)應(yīng)的非Nisin量相同）。采用Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡，層掃觀察 Nisin的分布情況。Nisin在425 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光 （EX） 下可發(fā)出475 nm波長(zhǎng) （EM） 的自發(fā)熒光［17］。

1.2.3液體培養(yǎng)條件下測(cè)量PHBHHx-Nisin的抑菌效應(yīng)

獲得種子液的方法同瓊脂擴(kuò)散法。所用Nisin的濃度為100、25和2.5 μg/g。將種子液稀釋104倍，即每毫升稀釋過(guò)的菌液約含105個(gè)菌落形成單位 （Colony-form ing unit，CFU），加入3片加工好的PHBHHx-Nisin薄膜到5 m L SI液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/m in培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣，從培養(yǎng)液中取出200 μL菌液測(cè)量OD600，根據(jù)OD600數(shù)值用新鮮的SI培養(yǎng)基將取出樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋后涂板，30 ℃靜置培養(yǎng)20 h后計(jì)算活菌數(shù)目得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果。每種Nisin含量的薄膜進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，對(duì)照組為不含Nisin的PHBHHx薄膜和不含Nisin的紙片。

2　結(jié)果與分析

2.1瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定PHBHHx-Nisin薄膜的抑菌效應(yīng)

藤黃微球菌是一種廣泛分布于空氣、土壤、水及動(dòng)植物表面的條件致病菌，被用作抑菌素（如 Nisin） 的指示菌株［21-22］。使用紙片和不含Nisin的PHBHHx薄膜的對(duì)照組并沒(méi)有抑菌效應(yīng)（圖1A和圖1B的0 μg/g），說(shuō)明抑菌效應(yīng)的來(lái)源正是Nisin。Nisin含量達(dá)到25 μg/g以上時(shí)表現(xiàn)出穩(wěn)定大小的抑菌圈 （圖 1A）；Nisin含量在2.5 μg/g及以下時(shí)的抑菌效果則不穩(wěn)定 （圖1B）；這暗示Nisin在PHBHHx薄膜內(nèi)部的分布并不均勻，因此Nisin濃度越低則抑菌效果平行性越差。隨著Nisin濃度的增加，PHBHHx薄膜抑菌效果顯著增強(qiáng)，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。

圖1　瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量含有乳酸鏈球菌素的PHBHHx膜片的抑菌效應(yīng)Fig. 1 Antibacterial activity of Nisin-embedded PHBHHx films quantified using agar diffusion method. （A）Inhibition of M icrococcus luteus （NCIB 8166） grow th using PHBHHx films containing Nisin at six different concentrations （0， 25， 100， 400， 1 600， and 6 400 μg/g， respectively）. （B） The inhibitory effect of PHBHHx films containing Nisin at three different concentrations （0， 0.25， and 2.5 μg/g， respectively）. The diameter of the films is 6 mm.

2.2Nisin在PHBHHx薄膜中的物理分布

圖3展示了100 μg/g和25 μg/g兩種Nisin濃度的PHBHHx薄膜的顯微成像結(jié)果。圖中的綠色亮點(diǎn)即為Nisin蛋白質(zhì)顆粒的自發(fā)熒光，直徑約10-70 μm，密度隨摻入的Nisin濃度增加而增大。圖中直徑較大的暗色斑點(diǎn)可能是隨Nisin一起摻入的無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)：僅向PHBHHx中摻入NaCl即可使其具有相同的顯微特征 （結(jié)果未列出）。

圖2　PHBHHx膜片抗菌效應(yīng)對(duì)Nisin含量的依賴關(guān)系Fig. 2 Nisin-dependent antibacterial activity of PHBHHx films. The Nisin concentrations are 0.25， 2.5，25， 100， 400， 1 600 and 6 400 μg/g， respectively. Error bars represent the standard deviation of the mean from six separate tests.

2.3PHBHHx薄膜中Nisin的釋放情況

圖3　激光共聚焦顯微鏡觀察Nisin顆粒在PHBHHx膜片內(nèi)部的物理分布Fig. 3 The distribution of Nisin particles in PHBHHx matrices imaged by confocal laser m icroscopy in cross-section view. The green dots are Nisin particles. （A） 25 μg/g Nisin. （B） 100 μg/g Nisin.

根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法的實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果，選取 4 種 Nisin濃度 （100、25、2.5、0.25 μg/g） 的PHBHH x薄膜做液體培養(yǎng)抑菌實(shí)驗(yàn)。將PHBHHx-Nisin薄膜加到藤黃微球菌生長(zhǎng)所需的SI液體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，在特定時(shí)間點(diǎn)取樣后用新鮮SI培養(yǎng)液將樣品稀釋不同的倍數(shù)后涂板，30 ℃靜置培養(yǎng)20 h，統(tǒng)計(jì)平板上的活菌數(shù)目。結(jié)果圖4所示，對(duì)照組 （加入了不含Nisin的PHBHHx薄膜的培養(yǎng)基） 在培養(yǎng)22 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期 （約8.8 log CFU/m L）。含有2.5 μg/g PHBHHx-Nisin薄膜的樣品中，菌的密度在早期生長(zhǎng)中急速下降約 3個(gè)數(shù)量級(jí)，原因可能是大量菌體被薄膜釋放的Nisin殺死；但由于含量不高的Nisin被耗盡，少數(shù)幸存的活菌導(dǎo)致8 h后菌體密度迅速上升，在22 h也達(dá)到了穩(wěn)定期 （圖4）。25 μg/g與100 μg/g的PHBHHx-Nisin薄膜所在培養(yǎng)液沒(méi)有出現(xiàn)藤黃微球菌菌體復(fù)蘇的現(xiàn)象，說(shuō)明薄膜釋放的 Nisin可以在細(xì)菌生長(zhǎng)早期就將其完全殺滅 （圖 4）。這些結(jié)果證明了分布在薄膜中的 Nisin可以被順利釋放出來(lái)且抑菌效應(yīng)能得到長(zhǎng)時(shí)間的維持。

圖 4 液體培養(yǎng)條件下 PHBHHx-Nisin膜片的抗菌活性隨時(shí)間的變化Fig. 4 Inhibitory effect of PHBHHx-Nisin on the grow th of Micrococcus luteus in liquid media. Note that when Nisin concentration is higher than 25 μg/g，the bacterial grow th was inhibited throughout the incubation time， so the corresponding curves overlap w ith the horizontal axis. Error bars represent the standard deviation of the mean from three separate tests.

3　討論

本研究首次將 Nisin經(jīng)過(guò)溶劑澆鑄的方法嵌入到PHBHHx中，使得PHBHHx具有抗菌活性，其生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便，極易應(yīng)用于工業(yè)放大。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的同類(lèi)研究將目光集中在 PLA和PBS系列的生物塑料上，而針對(duì)性能更為多樣化、生物降解性與相容性更高的PHA系列的工作則是空白。為了進(jìn)一步說(shuō)明本文方法對(duì)于PHA系列的通用性，我們采用另外 3種 PHA （PHB、PHBV、P3HB4HB） 分別制備了PHB-Nisin、PHBV-Nisin與P3HB4HB-Nisin共3種抗菌PHA材料，并進(jìn)行了瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然不同的材料間表現(xiàn)出一定的差異，但3種含有Nisin的PHA材料均呈現(xiàn)出靈敏的、顯著的抗菌活性 （結(jié)果未列出）。

Nisin可以通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)的方式整合到其他介質(zhì)中?？紤]到Nisin需要被充分釋放才能最大程度發(fā)揮抑菌活性，因此我們選擇溶劑澆鑄這一非共價(jià)結(jié)合的方法將 Nisin整合到 PHA中。本研究中 Nisin以“不溶顆粒”的形式混在PHA中；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明利用此種方法，在5 m L液體培養(yǎng)基中僅僅 0.33 μg的 Nisin （換算為Nisin濃度則為 0.07 μg/m L） 就足以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；這是截止到目前已報(bào)道的抑菌活性最高的抗菌塑料。

驗(yàn)證 PHA-Nisin薄膜在液體培養(yǎng)條件下的抑菌情況時(shí)我們觀察到，25 μg/g和 100 μg/g Nisin含量的 PHA薄膜在藤黃微球菌生長(zhǎng)初期就沒(méi)有了生長(zhǎng)跡象。然而，當(dāng) Nisin的含量為2.5 μg/g時(shí)，在生長(zhǎng)前8 h活菌數(shù)急劇下降后，菌體密度反而出現(xiàn)復(fù)蘇現(xiàn)象。這說(shuō)明此時(shí)被釋放到液體中的Nisin尚不足以殺滅全部的菌體，且后續(xù)釋放乏力。因此，2.5 μg/g的Nisin含量對(duì)于液體培養(yǎng)條件下的抑菌來(lái)說(shuō)是不夠的。關(guān)于固體與液體之間的抑菌濃度差別，有兩個(gè)潛在的影響因素：一是Nisin的擴(kuò)散方式不同，在液體振蕩的條件下Nisin比在固體平板上更容易擴(kuò)散稀釋?zhuān)欢遣煌纳L(zhǎng)條件導(dǎo)致細(xì)菌的代謝物不同，而后者會(huì)顯著影響Nisin的活性［23］。

Nisin是由 34個(gè)氨基酸組成的、硫醚鍵形成 5個(gè)內(nèi)環(huán)的短肽，常為二聚體或四聚體［24］。Nisin作為食品防腐劑的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明其在偏酸性條件下保存時(shí)間長(zhǎng)，高壓處理后活性保持良好，在合適的條件下甚至可以忍受一定程度的高溫。前人報(bào)道，在pH 5-7時(shí)，經(jīng)歷巴氏消毒后Nisin可保持至少80%的活性［10］。在偏酸性條件下，常規(guī)高壓蒸汽滅菌后Nisin的活性仍能保持 50%以上；一些 Nisin突變體甚至可以忍受100 ℃及以上的高溫處理10 m in而保持80%抑菌活性［25］。這些物理?xiàng)l件符合工業(yè)實(shí)踐中PHA的加工窗口，因此抗菌PHA塑料的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程N(yùn)isin的降解失活很可能不是難題。

本研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應(yīng)的生物可降解塑料PHA提供了重要參考。特別值得注意的是，這里使用Nisin這一被公認(rèn)為安全食品防腐劑的天然產(chǎn)物作為抗菌成分，可以有效遏制食品腐敗菌和條件致病菌的生長(zhǎng)。因此抗菌PHA塑料在醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域可預(yù)見(jiàn)的應(yīng)用范圍相當(dāng)可觀，包括食品包裝袋、飲水機(jī)接口、電冰箱內(nèi)置塑料等等。

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（本文責(zé)編 郝麗芳）

November 17， 2015； Accepted: February 1， 2016

Preparation and characterization of polyhydroxyalkanoate biop lastics w ith antibacterial activity

Qiu li Lou1, Yim ing M a2, Xuem ei Che2, Jin Zhong3, Xiaoxia Sun1, and Haoqian Zhang2

1 College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China
2 BluePHA (Beijing) Co.， Ltd， Beijing 100084， China
3 Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China

Polyhydroxyalkanoates （PHAs）， as a novel class of biopolymer， are attracting more attention due to their diverse material properties and environment-independent biodegradability. Here we report the preparation of PHA exhibiting efficient antibacterial activity by embedding Nisin， a food additive generally recognized as safe， into poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate） （PHBHHx）， a type of PHA w ith high biocompatibility. We first prepared Nisin-containing PHBHHx films using solvent casting method. Confocal laser scanning m icroscopy analysis showed that a well-mixed integrated structure of the films w ith an even distribution of the Nisin particles in the PHBHHx matrices. Then the antim icrobial activity of PHBHHx/Nisin films against M icrococcus luteus was quantified on agar plate by measuring the size of inhibition zone. Cultivation in liquid media further confirmed the releasing of Nisin from the films and the long-time antibacterial activity. Results showed that the threshold of Nisin concentration for long-time and effective inhibition against bacteria grow th is 25 μg/g. These results altogether establish a technological foundation for the application of PHA in biomedicine and food industry.

polyhydroxyalkanoate， Nisin， antibacterial plastics， M icrococcus luteus

Corresponding authors: Xiaoxia Sun. Tel: +86-591-83789367； E-mail: joesxiaox@163.com Haoqian Zhang. Tel: +86-10-62757544； E-mail: zhanghaoqian@bluepha.com