李田，張亮，申琦，趙威，李黎，呂銀，蔣貴兵，閆登峰，肖俊杰，陳萍

1 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 4007162 重慶市蠶業(yè)管理總站，重慶 400716

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

家蠶血淋巴體外黑化觀察及相關(guān)黑色素合成催化酶基因

李田1，張亮1，申琦1，趙威1，李黎1，呂銀1，蔣貴兵2，閆登峰1，肖俊杰1，陳萍1

1 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716
2 重慶市蠶業(yè)管理總站，重慶 400716

李田， 張亮， 申琦， 等. 家蠶血淋巴體外黑化觀察及相關(guān)黑色素合成催化酶基因. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1093-1103.

Li T， Zhang L， Shen Q， et al. In vitro observation of haemolymph melanization and melanin-related biosynthesis enzyme genes in silkworm， Bombyx mori. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1093-1103.

觀察不同生長(zhǎng)期家蠶幼蟲血淋巴在體外的黑化速度和對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果顯示，隨食桑生長(zhǎng)幼蟲血淋巴的黑化速度逐漸變快，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，黑色素合成催化酶BmTan、BmPo-1、BmYellow-f和BmDdc等的基因在家蠶5 L 3 d血淋巴中表達(dá)量高，BmBlack、BmYellow 和BmPah等的基因也有明顯表達(dá)。qPCR分析顯示，黑化病蠶中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack，尤其Bmddc表達(dá)發(fā)生了顯著上調(diào)。與對(duì)照相比，Ddc酶的抑制劑能顯著抑制脂多糖對(duì)血淋巴的誘導(dǎo)黑化作用。用大腸桿菌注射家蠶幼蟲，血淋巴中多巴和多巴胺的含量明顯上升。這些表明家蠶幼蟲血淋巴黑化與防御免疫有關(guān)，Bmddc很可能在幼蟲血淋巴的免疫黑化中發(fā)揮作用。

家蠶血淋巴，黑化反應(yīng)，黑色素合成催化酶，免疫應(yīng)答

昆蟲是地球上最龐大的生物種群，分布于除深海外的各種自然環(huán)境中［1］，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和防御免疫能力。昆蟲為開放式血液循環(huán)，所有組織器官浸浴在血淋巴中，當(dāng)外源物攻破昆蟲體壁這個(gè)物理屏障后，首先面對(duì)的是血淋巴，血淋巴是昆蟲免疫防衛(wèi)的重要組織。昆蟲免疫防御中常有黑化現(xiàn)象。黑色素形成過程中產(chǎn)生的自由氧 （ROI）、自由氮 （RNI） 以及醌類等多種有毒分子物質(zhì)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等有破壞作用［2-3］。在昆蟲體內(nèi)被黑化的細(xì)菌置于固體培養(yǎng)基上幾乎不會(huì)生長(zhǎng)［4］，注入煙草天蛾Manduca sexta體內(nèi)的熒光微球體被血淋巴黑化包裹［5］，用含大腸桿菌Escherichia coli或金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus的鎢絲針穿刺黑腹果蠅Drosophila melanogaster胸部，傷口處的細(xì)菌被黑化［6］。埃及伊蚊Aedes aegypti中發(fā)現(xiàn)的免疫黑化蛋白酶 （Immune melanization proteases，IMP-1和IMP-2） 可以通過調(diào)控血淋巴黑化來抑制病原物生長(zhǎng)［7］。這些表明，黑化反應(yīng)不僅是昆蟲免疫應(yīng)答的一個(gè)伴隨現(xiàn)象，而且是昆蟲進(jìn)行免疫防衛(wèi)的一種手段。

家蠶Bombyx mori是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是研究鱗翅目的模式昆蟲，有關(guān)家蠶的免疫防御機(jī)制受到高度關(guān)注。在免疫黑化方面，許平震等［8］克隆鑒定出家蠶14個(gè)模式識(shí)別受體編碼基因，其中包括10個(gè)肽聚糖識(shí)別蛋白 （PGRP） 基因和4個(gè)β-葡聚糖識(shí)別蛋白 （βGRP） 基因。趙萍等［9］從家蠶基因組上共鑒定了 143個(gè)家蠶絲氨酸蛋白酶基因，80種絲氨酸蛋白酶抑制劑基因。最近徐曼等［10］認(rèn)為Bm lz基因能夠通過誘導(dǎo)酚氧化酶原的表達(dá)增強(qiáng)血淋巴黑化作用。這些研究多集中于黑色素合成上游酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)及調(diào)控過程。對(duì)于黑色素合成下游相關(guān)催化酶基因的研究，在所有昆蟲中果蠅Drosophila研究的最為清楚［11］。2011年于紅松等［12］通過生物信息學(xué)方法從家蠶基因組中搜索到與果蠅同源的 9個(gè)黑色素合成途徑相關(guān)基因并進(jìn)行了鑒定與分析。有研究證明家蠶黑色素代謝途徑上催化酶酪氨酸羥化酶 （Tyrosine hydroxylase，Th）、 N-β-丙酰多巴胺合成酶 （N-βalanyldopam ine synthetase，Ebony）、N-β-丙酰多巴胺水解酶 （N-β-alanyldopam ine hydrolase，Tan）、芳香烷基N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylam ine-N-acetyl transferase，Dat）、苯丙氨酸羥化酶 （Phenylalanine hydroxylase，Pah）和鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶 （Guanosine triphosphate cyclohydrolase，GTPCH I） 等編碼基因的表達(dá)與體壁斑紋黑色素的形成及沉積相關(guān)［13-18］。本研究調(diào)查了不同生長(zhǎng)期家蠶幼蟲血淋巴的黑化能力及其免疫防衛(wèi)能力，分析了黑色素合成催化酶基因及其編碼產(chǎn)物與家蠶血淋巴免疫的關(guān)系，為進(jìn)一步全面揭示家蠶免疫防御機(jī)制提供更多的信息和基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試家蠶品種大造 （由本實(shí)驗(yàn)室保存），幼蟲常規(guī)條件下用桑葉飼養(yǎng)。大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌為過夜活化的新鮮菌液 （OD600約為0.8）。

1.2總RNA的提取、cDNA合成及引物設(shè)計(jì)

參照Trizol （Invitrogen公司） 試劑盒說明書提取總RNA。將組織用液氮研磨后加入Trizol，室溫放置5 m in充分裂解后12 000 r/m in離心5 m in，取上清并加入200 μL氯仿振蕩混勻，放置10 m in后12 000 r/m in離心15 m in，吸取上層水相并加入 500 μL異丙醇混勻，室溫放置15 m in后12 000 r/m in離心10 m in，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次，室溫晾干后用DEPC水溶解RNA沉淀，利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 （Promega公司），合成cDNA第一鏈［19］?；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，實(shí)驗(yàn)用引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3RT-PCR分析

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 m in；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 m in，12 ℃保存。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

1.4熒光定量PCR檢測(cè)

利用家蠶轉(zhuǎn)錄起始因子4A基因（BGIBMGA003186） 作為內(nèi)參。熒光定量 PCR反應(yīng)儀器為ABI7500Fast，反應(yīng)體系為20 μL，熱啟動(dòng)程序?yàn)?5 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。其中每個(gè)模板進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將獲得的數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析。

1.5HPLC測(cè)定多巴和多巴胺含量

多巴、多巴胺樣品制備：收集家蠶血淋巴并加入等體積鹽酸緩沖液。在4 ℃、10 000 r/m in條件下離心10 m in后取上清液煮沸10 min，冷卻后加入等體積氯仿并顛倒混勻，4 ℃、10 000 r/min離心15 m in，取上清液過濾 （0.22 μm濾膜） 后作為上機(jī)樣品。

表1　引物序列Tab le 1 Prim er sequences

HPLC測(cè)定條件：色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水 （體積比為8∶100），流速為0.8 m L/min。物質(zhì)檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為 280 nm，吸收波長(zhǎng)為320 nm，檢測(cè)溫度為30 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：先制備質(zhì)量濃度為1 g/L母液，再將母液稀釋成不同濃度梯度后上機(jī)，根據(jù)濃度梯度和對(duì)應(yīng)的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線。多巴和多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得 R2值分別為 0.999和0.996，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度較好 （圖1），可以用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

多巴、多巴胺含量計(jì)算：采用峰保留值比較法和疊加法進(jìn)行定性分析，利用外標(biāo)法測(cè)峰面積對(duì)應(yīng)標(biāo)樣的回歸方程計(jì)算含量。

1.6大腸桿菌生長(zhǎng)觀察

圖1　多巴 (A)、多巴胺 (B) 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Dopa and Dopam ine standard curve. （A） Dopa. （B） Dopam ine.

在毛細(xì)針中將家蠶血淋巴與大腸桿菌新鮮菌液混合 6 h后通過無菌空氣盡可能把其中所有液體打出涂板，37 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1不同齡期家蠶血淋巴體外黑化觀察

我們選取4齡第1天至5齡第6天的幼蟲來調(diào)查家蠶不同生長(zhǎng)時(shí)期血淋巴黑化是否有差異，以及在不同保護(hù)溫度下血淋巴黑化是否有差異。觀察仍在毛細(xì)針中進(jìn)行［20］，血淋巴體積為10 μL。

對(duì)于4齡期共4 d的血淋巴來說 （圖2A），體外放置0.5 h時(shí)均保持透明狀態(tài)；放置12 h時(shí)，4齡第1天 （4 L 1 d） 的血淋巴仍保持透明狀態(tài)，但4 L 2 d的血淋巴能在毛細(xì)針粗端看到顏色略微加深，且4 L 3 d和4 L 4 d的血淋巴能在毛細(xì)針粗端看到明顯黑褐色；放置24 h時(shí)，4 L 1 d的血淋巴就能看到毛細(xì)針粗端顏色加深，4 L 2 d、4 L 3 d和4 L 4 d的血淋巴有明顯的黑褐色，并有隨幼蟲食桑生長(zhǎng)經(jīng)過時(shí)間增加黑化程度更強(qiáng)的趨勢(shì)。

對(duì)于5齡期共6個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)間的幼蟲血淋巴，體外放置0.5 h時(shí)，除低溫4 ℃保持透明狀態(tài)外，在室溫和高溫37 ℃保護(hù)的毛細(xì)針粗端均出現(xiàn)明顯的黑褐色，且黑褐色隨幼蟲經(jīng)過時(shí)間增加逐漸加深并向毛細(xì)針細(xì)端擴(kuò)展；放置12 h時(shí)，除5 L 1 d在4 ℃保護(hù)的血淋巴未見明顯變色外，其他樣品都有明顯的黑褐色，并有隨幼蟲食桑生長(zhǎng)和樣品的保護(hù)溫度提高、血淋巴變黑程度越深范圍越廣的初步特征；放置24 h時(shí)，所有血淋巴樣品都見黑褐色，從5齡初到5齡盛食期以及5齡上蔟前，血淋巴黑化程度和黑化范圍隨幼蟲經(jīng)過時(shí)間逐步變得更深更廣，這個(gè)現(xiàn)象特征比前面更加明顯突出 （圖2B）。

圖 2 毛細(xì)針管內(nèi)不同齡期家蠶血淋巴黑化的過程觀察Fig. 2 M elanization of haemolymph using different instars of silkworm in the capillary w ith time. （A） Days 4th instar larvae haemolymph. （B） Days 5th instar larvae haemolymph. RT: room temperateure.

總之，血淋巴在毛細(xì)針中的黑化速度和程度與家蠶幼蟲不同生長(zhǎng)時(shí)期以及保護(hù)溫度都有明顯關(guān)系。5齡期的血淋巴比4齡期的黑化快；同一齡期內(nèi)，齡初的血淋巴黑化較慢，齡末的血淋巴黑化較快；低溫 4 ℃保護(hù)的血淋巴變黑速度最慢，其次是室溫，37 ℃黑化最快。

2.2不同齡期家蠶血淋巴對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

為了探究家蠶血淋巴黑化作用的強(qiáng)弱與其殺滅外源微生物的能力是否相關(guān)，我們根據(jù)前面不同生長(zhǎng)期幼蟲血淋巴的體外黑化觀察實(shí)驗(yàn)，分別選取4 L 3 d和5 L 6 d兩個(gè)齡期的幼蟲血淋巴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用7.5 μL血淋巴與2.5 μL大腸桿菌混合6 h后，觀察大腸桿菌生長(zhǎng)狀況。同等條件下用7.5 μL PBS緩沖液 （pH 7.4） 代替家蠶血淋巴作對(duì)照。大腸桿菌與4 L 3 d幼蟲血淋巴混合反應(yīng)6 h后，平均菌落數(shù)為32個(gè)，與5 L 6 d家蠶血淋巴混合后平均菌落數(shù)為 8個(gè)，與 PBS混合 （對(duì)照） 后的平均菌落數(shù)為51個(gè)。大腸桿菌與家蠶血淋巴混合后生長(zhǎng)受到抑制，菌落數(shù)目明顯減少，達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性；黑化較強(qiáng)的5 L 6 d家蠶血淋巴對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用比黑化較弱的4 L 1 d血淋巴的抑制作用更強(qiáng)、效果更好，它們之間的差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的極顯著水平。結(jié)果如圖 3所示。這些暗示家蠶幼蟲血淋巴的黑化作用與防御免疫作用有關(guān)。

2.3血淋巴中黑色素合成相關(guān)催化酶基因表達(dá)分析

圖 3 不同齡期家蠶血淋巴對(duì)體外培養(yǎng)大腸桿菌增殖的影響Fig. 3 Influence of haemolymph using different instars of silkworm on the proliferation of Escherichia coli cultured in vitro. （A） The statistical analysis on the bacteria colonies between 4 L 3 d instar larvae haemolymph and 5 L 6 d instar larvae haemolymph. *P＜0.05， **P＜0.01 and ***P＜0.001. （B） Direct-view ing the bacteria colonies.

圖4　黑色素合成相關(guān)催化酶基因在5 L 3 d家蠶血淋巴中的表達(dá)模式Fig. 4 Expression pattern of enzyme genes related to melanin biosynthesis in 5 L 3 d instar larvae haemolymph.

黑色素合成需要多個(gè)步驟、多個(gè)酶參與一系列催化反應(yīng)，其中各個(gè)步驟的催化酶是黑色素合成的關(guān)鍵。家蠶造血器官功能發(fā)揮在5 L 3 d有一個(gè)高峰［21］。我們用RT-PCR分析5 L 3 d家蠶血淋巴中目前已報(bào)道的與黑色素合成相關(guān)的 Bmpah、Bmth、Bmblack、Bmyellow、Bmyellow-f、Bmdat1、Bmebony、Bmtan、Bmpo-1和Bmddc等10個(gè)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示 （圖 4），Bmtan （283 bp）、Bmpo-1 （500 bp）、Bmyellow-f （549 bp） 和Bmddc （663 bp） 等4個(gè)基因在正常血淋巴中均有高量表達(dá)，Bmblack （487 bp）、Bmyellow （464 bp） 和Bmpah （566 bp） 等 3個(gè)基因有清楚的擴(kuò)增帶，未發(fā)現(xiàn)Bmth、Bmebony和Bmdat1等3個(gè)基因明顯的擴(kuò)增帶。

2.4黑色素合成催化酶基因在黑化病蠶與正常蠶之間的表達(dá)差異分析

被蠅蛆寄生的家蠶，體壁上都有一個(gè)病原物進(jìn)入體腔的黑色創(chuàng)口 （圖5A）。發(fā)病嚴(yán)重的幼蟲通體透出黑褐色，體腔內(nèi)所有組織器官浸浴在黑褐色體液中，有腐爛趨勢(shì)，容易斷離。

為了探究黑化病蠶與黑色素合成催化酶基因是否有關(guān)，我們選取 5齡相同生長(zhǎng)期的健康幼蟲 （熟蠶） 和被蠅蛆寄生通體透出黑褐色的幼蟲 （圖5B），用q-PCR比較相關(guān)黑色素合成催化酶基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，Bmpah、Bmth、Bmblack、Bmddc、Bmyellow和Bmebony等6個(gè)基因在兩種蠶體中的表達(dá)量均發(fā)生明顯變化。除Bmpah在黑化病蠶中的表達(dá)量減少外，其余5個(gè)基因的表達(dá)水平在黑化病蠶中顯著增加，尤其是Bmddc表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)，表明黑化的病蠶能夠引起黑色素代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化。

圖5　正常上蔟蠶和黑化病蠶圖Fig. 5 Normal and black disease silkworm larval. （A）The early stage of silkworm being bit by flies. （B） The later stage of silkworm being bit by flies. The red arrow refers to flies bites.

圖 6 黑化病蠶中黑色素合成相關(guān)催化酶基因的表達(dá)分析Fig. 6 Effects of black disease silkworm on the relative expression of enzyme genes related to melanin biosynthesis. *P＜0.05， **P＜0.01 and ***P＜0.001，compared to the relative expression in normal silkworm.

2.5多巴脫羧酶 (Ddc) 抑制劑對(duì)血淋巴黑化的影響

多巴脫羧酶 （Ddc） 基因在5 L 3 d家蠶血淋巴中高量表達(dá)，在黑化病蠶中相比正常蠶體表達(dá)上調(diào)極顯著。為了探究 Ddc是否在家蠶血淋巴黑化中發(fā)揮催化作用，我們用 Ddc酶活性的特異抑制劑卡比多巴 （大連美侖） 來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。革蘭氏陰性菌胞壁主要成分脂多糖 （LPS，Sigma） 能夠迅速誘導(dǎo)家蠶體外血淋巴發(fā)生黑化反應(yīng)［20］。用5 L 3 d家蠶血淋巴7.5 μL與2.5 μL卡比多巴 （10 mg/m L，PBS為溶劑） 及2.5 μL LPS （1 mg/m L） 混合，PBS代替卡比多巴作為對(duì)照。觀察記錄時(shí)間點(diǎn)為混合后0、0.5、24 h。

由圖7中我們可以看出0 h時(shí)兩組毛細(xì)針中血淋巴呈透明狀，幾分鐘后PBS組毛細(xì)針粗端能看到顏色稍有加深，0.5 h后LPS誘導(dǎo)血淋巴明顯變黑，而加入卡比多巴的毛細(xì)針在0.5 h才見粗端血淋巴顏色有微弱加深，在24 h時(shí)PBS組整個(gè)毛細(xì)針管中血淋巴變?yōu)楹诤稚⒅饾u向細(xì)端延伸，而加入卡比多巴的血淋巴在24 h時(shí)呈黃色，整個(gè)過程中沒有出現(xiàn)血淋巴黑化現(xiàn)象。表明卡比多巴能夠抑制家蠶血淋巴黑化作用，即Ddc與家蠶血淋巴黑化作用有關(guān)。

2.6血淋巴中多巴 (Dopa) 和多巴胺(Dopam ine)含量

Ddc是使Dopa轉(zhuǎn)化成Dopam ine的重要催化酶［22］。Dopa和Dopam ine是黑色素合成的重要前驅(qū)物，對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有抑制作用［20］。用5 μL大腸桿菌注射5 L 3 d家蠶，然后用HPLC檢測(cè)幼蟲血淋巴中Dopa和Dopam ine含量，檢測(cè)時(shí)間為注射后6 h和24 h。以PBS代替大腸桿菌注射幼蟲為對(duì)照。每組重復(fù)3次，Dopa和Dopam ine含量是3次結(jié)果的平均。

圖7　卡比多巴對(duì)家蠶血淋巴黑化的影響Fig. 7 Influence of carbidopa on melanization of silkworm haemolymph.

圖8　多巴和多巴胺的色譜圖Fig. 8 Chromatograms of Dopa and Dopam ine. （A） The standards. （B） The experimental group.

圖 9 大腸桿菌感染后血淋巴中多巴和多巴胺含量檢測(cè)Fig. 9 Dopa and Dopam ine content detection in silkworm haemolymph induced by Escherichia coli. （A） Dopa. （B） Dopam ine.

正常條件下家蠶體內(nèi) Dopa含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Dopamine含量。未注射 （對(duì)照組） 時(shí)家蠶體內(nèi)Dopa和Dopam ine含量保持穩(wěn)定；注射PBS后6 h，Dopa和Dopam ine含量均明顯降低，且24 h時(shí)基本恢復(fù)正常水平；注射大腸桿菌后6 h相比PBS組來說，Dopa含量升高了88.5%，Dopam ine含量升高了2.3倍，24 h時(shí)Dopam ine含量恢復(fù)正常而Dopa含量相比PBS組降低了59.0%。

3　討論

不同生長(zhǎng)期家蠶幼蟲的血淋巴在體外黑化的速度不同：5齡幼蟲血淋巴比4齡的黑化速度快，同一齡期內(nèi)末齡幼蟲血淋巴比齡初幼蟲血淋巴黑化快。4 L 3 d和5 L 6 d的幼蟲血淋巴對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)均有抑制作用，其中5 L 6 d的幼蟲血淋巴抑制作用比4 L 3 d更強(qiáng)。這些表明隨家蠶幼蟲食桑生長(zhǎng)，血淋巴黑化速度變快，其防御免疫能力變強(qiáng)。這與先前認(rèn)為家蠶幼蟲對(duì)病原物的抵抗能力隨生長(zhǎng)發(fā)育增強(qiáng)的主要原因是由于體重的增加稀釋了病原物而引起的觀點(diǎn)［23］不一致。

家蠶幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育到5齡第3天，其造血器官功能發(fā)揮達(dá)到頂峰，此時(shí)血淋巴中基因的表達(dá)情況與血淋巴功能的發(fā)揮可能具有聯(lián)系。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，黑色素合成催化酶Bm Tan、BmPo-1、BmYellow-f和BmDdc等的基因在家蠶5 L 3 d血淋巴中有較高的表達(dá)，Bm Black、BmYellow和BmPah等的基因在5 L 3 d血淋巴中也有明顯表達(dá)。差異分析顯示，黑化病蠶中Bm tan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack，尤其Bmddc表達(dá)發(fā)生了顯著上調(diào)。這些基因在其他昆蟲的免疫黑化研究中也有報(bào)道，如苯丙氨酸羥化酶基因 （pah） 和 ddc在埃及伊蚊 Ae. Aegypti和騷擾阿蚊Armigeres subalbatus［24-25］、酪氨酸羥化酶基因 （th） 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua［26］、N-β丙酰多巴胺合成酶基因 （ebony）和 ddc在地中海實(shí)蠅 Ceratitis capitata［27-28］、ebony在擬步行蟲Tenebrio molitor［27］等。

Ddc酶的抑制劑能顯著抑制LPS對(duì)血淋巴的誘導(dǎo)黑化作用，說明 Ddc酶與家蠶血淋巴免疫黑化作用有關(guān)。BmDdc定位于家蠶BmN細(xì)胞中靠近核周圍的細(xì)胞質(zhì)中［29］。地中海實(shí)蠅中的ddc參與先天免疫反應(yīng)，調(diào)控血細(xì)胞的吞噬、小結(jié)和黑化作用［28］。結(jié)合Bmddc在家蠶5 L 3 d血淋巴中高量表達(dá)以及在黑化病蠶中表達(dá)顯著上調(diào)，我們認(rèn)為，Bmddc在家蠶血淋巴的免疫黑化中扮演了重要角色。

Dopa和 Dopam ine是黑色素合成的重要前體物質(zhì)，能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)［20］。當(dāng)大腸桿菌注射家蠶后6 h，這兩種物質(zhì)在血淋巴中的含量明顯上升，暗示這兩種物質(zhì)與幼蟲血淋巴免疫相關(guān)。當(dāng)侵染24 h后，Dopam ine含量恢復(fù)正常，而Dopa含量明顯低于正常。我們猜測(cè)：當(dāng)家蠶血淋巴受到浸染時(shí)，免疫應(yīng)答系統(tǒng)啟動(dòng)黑色素合成，Dopa和 Dopam ine作為合成黑色素的重要原料被大量生產(chǎn)，導(dǎo)致含量上升；隨著體內(nèi)病原物減少，血淋巴的免疫應(yīng)答機(jī)制逐漸停止，最終恢復(fù)常態(tài)，由于在黑色素合成中Dopa比 Dopam ine有更多的消耗途徑，致使侵染24 h后血淋巴中Dopa含量還未恢復(fù)常態(tài)。

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（本文責(zé)編 郝麗芳）

November 25， 2015； Accepted: February 17， 2016

Ping Chen. Tel/Fax: +86-23-68250084； E-mail: chenping1918@swu.edu.cn

In vitro observation of haemolym ph melanization and melanin-related biosynthesis enzyme genes in silkworm, Bombyx mori

Tian Li1, Liang Zhang1, Qi Shen1, Wei Zhao1, Li Li1, Yin Lü1, Guibing Jiang2, Dengfeng Yan1, Junjie Xiao1, and Ping Chen1

1 College of Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400716， China
2 Sericulture Management Station of Chongqing， Chongqing 400716， China

The observation statistics suggested that the haemolymph melanization speed of larvae became fast and the grow th inhibition of Escherichia coli was strong as the quantities of feeding on mulberry leaves increased. The RT-PCR result showed that the mRNA expressions of melanin biosynthesis enzyme Bm Tan， BmPo-1， BmYellow-f and BmDdc were high in the haemolyph of 5 L 3 d larvae. The q PCR analysis showed Bmtan， Bmddc， Bmyellow， Bmebony and Bmblack， especially Bmddc expression were significantly higher in black disease larvae than in normal larvae. Compared w ith control， Ddc inhibitors drastically inhibited the lipopolysaccharide-induced haemolymph melanization. In addition， the content of Dopa and Dopam ine markedly rose after E. coli injection. These indicated that haemolymph melanization was linked to immune defenses and Bmddc may play a role in melanization response of haemolymph immune in silkworm.

haemolymph of Bombyx mori， melanization， melanin biosynthesis enzyme， immune response

Supported by: Natural Science Fundation of Chongqing （No. 2013jjB80004）， Graduate Student Innovative Research Projects of Chongqing （No. CYS14048）， National Special Fund for Silk Development of Chongqing in 2015.

重慶市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 （No. 2013jjB80004），重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 （No. CYS14048），重慶市2015國(guó)家繭絲綢發(fā)展專項(xiàng)資金資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160307.1410.004.html