安云鶴，高麗娟，李俊博，田彥捷，王金龍，鄭學(xué)娟，武會(huì)娟

1 北京市理化分析測(cè)試中心，北京 1000892 北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100094

生物技術(shù)與方法

PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)細(xì)菌群落多樣性測(cè)序分析的影響

安云鶴1，2，高麗娟1，2，李俊博1，2，田彥捷1，2，王金龍1，2，鄭學(xué)娟1，2，武會(huì)娟1，2

1 北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089
2 北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100094

安云鶴， 高麗娟， 李俊博， 等. PCR 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)細(xì)菌群落多樣性測(cè)序分析的影響. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1115-1123.

An YH， Gao LJ， Li JB， et al. Influence of PCR cycle number on microbial diversity analysis through next generation sequencing. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1115-1123.

運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析復(fù)雜樣品中微生物群落組成及變化趨勢(shì)，已經(jīng)成為目前微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究以復(fù)雜土壤樣品和應(yīng)用范圍較廣的瘤胃食糜樣品為對(duì)象，選取20、25和30三個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)分別對(duì)樣品的16S rRNA基因的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。最后通過(guò)數(shù)據(jù)分析比較不同的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)細(xì)菌多樣性測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越多，捕獲到的細(xì)菌數(shù)量和種類越多；但并非循環(huán)數(shù)越多，群落中的微生物組成比例最優(yōu)。整體來(lái)看，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，樣品中物種的數(shù)量和組成是最優(yōu)的。

PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，高通量測(cè)序，微生物多樣性分析

目前，能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的微生物種類占自然界中微生物總數(shù)的不到1%，絕大多數(shù)尚未被人類所認(rèn)識(shí)［1］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR指紋技術(shù)［2-3］、DNA 文庫(kù)［4-5］、RAPD［6-7］、ITS［8-9］、DGGE［10-11］等技術(shù)相繼被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)及基因資源的開發(fā)利用，從而擺脫了培養(yǎng)的限制。尤其近幾年，新一代測(cè)序技術(shù)以高通量、速度快、低成本等特點(diǎn)迅速發(fā)展，在微生物多樣性研究領(lǐng)域，正在逐步取代傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法［12-16］，從而進(jìn)一步豐富和拓展了人們對(duì)于未培養(yǎng)微生物的認(rèn)識(shí)。

利用高通量測(cè)序技術(shù)研究微生物的多樣性，對(duì)于樣品的要求較為嚴(yán)格。其中，目的片段的擴(kuò)增是進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序的關(guān)鍵步驟之一。不同的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)會(huì)直接影響最終數(shù)據(jù)分析中微生物種群的組成和豐度。由此可見，在微生物多樣性測(cè)序中，環(huán)境樣品的PCR擴(kuò)增是非常關(guān)鍵和重要的環(huán)節(jié)。

盡管之前已有研究對(duì)土壤和羊瘤胃食糜樣品擴(kuò)增條件［17-19］的報(bào)道，但大多是基于 DGGE方法的，并且很少涉及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化。目前對(duì)高通量測(cè)序方法過(guò)程中，不同類型樣品的PCR擴(kuò)增條件等方面尚未有系統(tǒng)的研究。本研究以土壤和羊瘤胃食糜樣品為對(duì)象，對(duì)最適PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行了比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同DNA模板量情況下，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越多捕獲到的微生物種類越多，但會(huì)造成優(yōu)勢(shì)菌群的過(guò)量擴(kuò)增，從而使其比例變化顯著。

1　材料與方法

1.1DNA提取

土壤樣品直接稱取250 mg進(jìn)行后續(xù)操作；食糜樣品離心沉淀并用PBS洗滌后用于與處理土壤樣品同樣的后續(xù)操作。樣品中加入 800 L CTAB緩沖液振蕩2 m in，加0.3 g 0.1 mm研磨珠和0.1 g 0.5 mm研磨珠，每隔2 m in振蕩1次，持續(xù)30 m in；70 ℃水浴20 m in后離心收集上清，加入RNAase 37 ℃水浴30 m in以去除樣品中的RNA 污染；加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）振蕩 30 s至呈白色乳液，離心收集上清；重復(fù)萃取步驟1次后，加入0.8倍體積異丙醇，充分混勻，室溫放置5-10 m in，放入-20 ℃過(guò)夜沉淀DNA；高速離心20 m in，去除上清，用70%乙醇洗滌沉淀，最后風(fēng)干沉淀并用50-100 L去離子水溶解。最后用BioSpec-nano核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量，同時(shí)取500 ng DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2PCR擴(kuò)增

選取土壤和食糜樣品各 25 ng，分別利用Ex Taq酶對(duì) 16S rRNA基因的 V3可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)分別選取 20、25和 30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增引物為：Forward：5′-CCTACGGGA GGCAGCAG-3′，Reverse：5′-ATTACCGCGGCT GCTGG-3′。每一條前向引物的5′末端均加入10 bp的一段barcode序列，用于區(qū)分不同條件的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為S-20c、S-25c、S-30c、C-20c、C-25c和C-30c。

1.3文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

將6個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物按照每個(gè)100 ng的質(zhì)量進(jìn)行混合后，對(duì)混合產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平加 A、連接接頭和少量擴(kuò)增進(jìn)行富集。對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行Agilent 2 100和QPCR質(zhì)檢，合格后用于M iseq 2×150 bp的測(cè)序。

1.4分析軟件

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去掉接頭和低質(zhì)量的測(cè)序序列，得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，并用fastqc軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用FLASH軟件對(duì)高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，獲得更多含barcode的測(cè)序序列。再使用QIIME軟件根據(jù)barcode序列將該組裝結(jié)果回歸樣品，并對(duì)每個(gè)樣品的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。然后使用uclust軟件根據(jù)序列相似性 （閾值為97%） 進(jìn)行聚類，得到 OTU （操作分類單元） 序列，并進(jìn)行優(yōu)化和分類。本研究采用菌群豐富度指數(shù) chao1、ACE，菌群多樣性指數(shù)Simpson、Shannon和菌群覆蓋度指數(shù)goods coverage、observed species對(duì)菌群進(jìn)行多樣性分析。最后使用 greengenes數(shù)據(jù)庫(kù) （201305版本） 并根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，分析樣品在各分類水平上的物種組成比例情況。

1.5主要試劑和儀器

土壤樣品 （簡(jiǎn)稱 S），為山東冬季未經(jīng)圍填的距離圍填海區(qū)域1.5 km、距表層15 cm的植物根系土壤。樣品采集后，冰塊運(yùn)送并于 24 h內(nèi)處理；羊瘤胃食糜樣品 （簡(jiǎn)稱 C），取自立即處死的羊瘤胃胃液，經(jīng)紗布過(guò)濾處理，并立即進(jìn)行核酸提?。籖NAase購(gòu)自美國(guó)NEB公司；0.1 mm和0.5 mm研磨珠購(gòu)自美國(guó)BioSpec公司；CTAB （十六烷基三甲基溴化銨）、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇等均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Truseq DNA library prep kit、Illum ina 2×150 bp測(cè)序試劑均購(gòu)自美國(guó)Illum ina公司。高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó) Eppendorf公司；BioSpec-nano核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自日本島津公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；M iseq測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)Illum ina公司。

2　結(jié)果與分析

2.1土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA提取

按照材料與方法中DNA提取步驟提取土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA，然后用BioSpec-nano測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量 （表1）。結(jié)果表明，土壤樣品的DNA濃度為12.25 ng/L，食糜的提取濃度為11.85 ng/L，A260/280的值均在1.7-2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖 1所示，表明提取的微生物基因組完整，沒有RNA等污染。

2.2不同的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)OTU和稀釋曲線的影響

表1　土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA提取濃度Table 1 DNA concentration extracted from soil and chyme sam p les

分別對(duì)土壤和食糜樣品的 16S V 3區(qū)進(jìn)行20、25和30三個(gè)不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增，最終通過(guò)數(shù)據(jù)分析觀察不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)最終數(shù)據(jù)的OTU數(shù)目和稀釋曲線的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食糜樣品的OTU數(shù)目隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加而顯著增加，而土壤樣品的OTU數(shù)目在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為 25時(shí)最高；當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加至 30，其OTU數(shù)目反而有所下降，但仍較擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為20時(shí)的OTU數(shù)目多 （圖2A）。S-20c、S-25c、S-30c的OTU數(shù)目分別為5 524、11 852和8 172；C-20c、C-25c、C-30c的OTU數(shù)目分別為1 737、2 663和7 233。每個(gè)樣品的稀釋曲線基本都呈逐漸平緩的趨勢(shì) （圖2B），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)基本能夠覆蓋目前狀態(tài)下的微生物種類。

圖1　土壤和食糜樣品DNA膠圖Fig. 1 Electrophoretogram of DNA extracted from soil and chyme samples. S: soil； C: chyme； M: 1 kb DNA marker.

2.3不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)微生物數(shù)量和種類的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，微生物數(shù)量都呈上升趨勢(shì)。但土壤樣品和食糜樣品的情況略有不同，土壤樣品在擴(kuò)增至25個(gè)循環(huán)時(shí)，微生物數(shù)量最多，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加至 30時(shí)，微生物的數(shù)量改變不大。如圖3所示，S-20c、S-25c和S-30c獲取的微生物數(shù)目分別是：49 475、169 257和147 895。而對(duì)于食糜樣品，微生物的數(shù)量隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加而呈逐漸上升的趨勢(shì)，但擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，較擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)的微生物數(shù)量上升緩慢。如圖 3所示，

C-20c、C-25c和C-30c獲取的微生物數(shù)目分別是：17 631、44 788和56 492。

圖2　不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)OTU和稀釋曲線的影響Fig. 2 Effect of different amplification cycles on OTU and Rarefaction curves. （A） Effect of different amplification cycles on OTU in soil and chyme samples. （B） Effect of different amplification cycles on Rarefaction curves in soil and chyme samples.

圖3　不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)微生物數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of different amplification cycles on m icrobial population.

從微生物多樣性分析的結(jié)果來(lái)看，物種較為豐富的土壤樣品，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，其微生物種類為16 263，基本達(dá)到飽和程度；當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，樣品中的微生物種類為14 188，微生物的種類沒有增加，反而有一定程度的降低 （表 2）。而對(duì)于食糜樣品，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，捕獲到的微生物種類呈遞增趨勢(shì)。如表2所示，C-20c/25c/30c捕獲的微生物種類分別是2 202、3 908和8 030。

在門水平上對(duì)樣品中微生物的群落組成進(jìn)行分析的結(jié)果表明，并非擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越多，樣品中微生物的群落組成越豐富。對(duì)于物種含量較豐富的土壤樣品來(lái)說(shuō)，3個(gè)不同的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)于豐度較高菌門的微生物捕捉是一致的，但對(duì)豐度較低菌門的微生物捕捉差別較大。當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，微生物的種類最多；而當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，微生物的種類反而會(huì)減少，尤其是豐度較低的菌門微生物，很多在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為 25時(shí)捕捉到的微生物種類缺失，如BHI80-139、H-178、LD1、AncK 6等，組成比例也相應(yīng)地變化較大 （圖4A）。而對(duì)于物種含量較少的食糜樣品，總體來(lái)看，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，物種含量也相應(yīng)增多。但當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，其優(yōu)勢(shì)菌門的微生物含量比例變化較大 （圖4B）。因此，從2種樣品的分析結(jié)果來(lái)看，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，物種的豐富度和群落組成比例更為合理。

3　討論

高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)對(duì)高質(zhì)量樣品的快速測(cè)序，以一種更為便捷經(jīng)濟(jì)的方式，可以獲得樣品中全面、準(zhǔn)確、無(wú)偏的數(shù)據(jù)信息。也正因如此，利用高通量測(cè)序技術(shù)的微生物多樣性測(cè)序［12-14，16］和宏基因組測(cè)序［15，20-21］越來(lái)越得到研究者的重視和青睞，其應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣。

表2　不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)微生物種類的影響Tab le 2 Effect of different am p lification cycles on m icrobial species

圖4　不同擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)微生物門水平群落組成的影響Fig. 4 Effect of different amplification cycle number on m icrobial community composition. （A） Effect of different amplification cycle number on m icrobial community composition in soil samples. （B） Effect of different amplification chloroflexi cycle number on m icrobial community composition in chyme samples.

高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品的要求較高，不合格的樣品質(zhì)量將造成后續(xù)數(shù)據(jù)分析的巨大偏差。土壤中富含腐殖酸等化合物［22］，因此提取的DNA純度往往不能令人滿意，影響后續(xù)PCR反應(yīng)和DNA測(cè)序［23］。存在于動(dòng)物和人體中的食糜樣品，無(wú)論是取自胃部還是腸道，其中所含微生物種類對(duì)于健康［24］、養(yǎng)殖［13］、發(fā)酵［25］等領(lǐng)域均具有重要的理論意義。在此研究中，我們選取環(huán)境樣品中較難處理的土壤樣品和應(yīng)用范圍較廣的食糜樣品，旨在得到一套可用于指導(dǎo)高通量測(cè)序前期樣品DNA提取及擴(kuò)增條件的技術(shù)參數(shù)。

從DNA的提取結(jié)果來(lái)看，不論是土壤樣品，還是食糜樣品，DNA的質(zhì)量均符合要求。我們選取25 ng DNA作為模板成功地進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用于建庫(kù)、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。從數(shù)據(jù)產(chǎn)生的OTU來(lái)看 （圖2A），土壤樣品獲得的OTU數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于食糜樣品，這暗示土壤中所含的細(xì)菌種類較多，而食糜樣品中種類較少。此外，土壤中所含的細(xì)菌數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于食糜樣品 （圖 3）。這些數(shù)據(jù)均表明，土壤樣品中微生物的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于食糜樣品。因此在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的選擇上也有所不同。

就土壤樣品而言，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)達(dá)到25時(shí)，其細(xì)菌種類和數(shù)量均達(dá)到最高值。再增加循環(huán)數(shù)，二者均會(huì)有所降低 （圖 3和表 2）。同時(shí)，從群落組成的結(jié)果來(lái)看，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，土壤中微生物的組成比例最優(yōu) （圖4A）。不但保持?jǐn)U增循環(huán)數(shù)為20時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌門種類和比例，同時(shí)最大程度增加了劣勢(shì)菌門的種類。而當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，不但會(huì)丟失低擴(kuò)增循環(huán)數(shù)下捕捉到的劣勢(shì)菌，如BHI80-139，并且增加的劣勢(shì)菌種類也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為 25時(shí)的結(jié)果。

在食糜樣品中，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，細(xì)菌種類和數(shù)量都呈上升趨勢(shì)。其中，細(xì)菌的種類隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，上升趨勢(shì)顯著 （表2）；而擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，細(xì)菌的數(shù)量只比擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)的有小幅提升 （圖3），說(shuō)明當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，細(xì)菌的數(shù)量已經(jīng)趨于飽和。這些數(shù)據(jù)表明，從擴(kuò)增循環(huán)數(shù)25增加至30，擴(kuò)增的產(chǎn)物總量變化不大，而種類發(fā)生了變化。從食糜樣品的群落組成來(lái)看，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30時(shí)，4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌，如擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、軟壁菌門 Tenericutes、變形菌門Proteobacteria，其比例組成較擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為20和25時(shí)均有大幅變化。而劣勢(shì)菌得到了大幅擴(kuò)增，不但種類更多，同時(shí)組成比例也相應(yīng)增大 （圖4B）。

因此，對(duì)于食糜這類微生物含量較低的樣品而言，如果要關(guān)注優(yōu)勢(shì)菌的種類和比例，選擇擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25會(huì)更有利于結(jié)果分析；如果要關(guān)注其中的劣勢(shì)菌，則選擇擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為 30會(huì)更有利。對(duì)于土壤這種微生物含量豐富的樣品，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)選擇 25是最優(yōu)的。這與利用DGGE法分析微生物多樣性，所選用的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)有所不同。DGGE技術(shù)主要是利用梯度變性膠來(lái)分離DNA片段。其原理是不同堿基組成的DNA雙螺旋，在線性梯度變性劑中發(fā)生解鏈的位置不同，從而造成在變性膠中涌動(dòng)的位置不同而達(dá)到分離的目的。因此，在進(jìn)行電泳前，樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物要滿足兩個(gè)條件：一個(gè)是盡可能保持?jǐn)U增產(chǎn)物的穩(wěn)定性以增加電泳時(shí)間，達(dá)到精確分離的目的；一個(gè)是盡量增加擴(kuò)增產(chǎn)物量以保證每個(gè)分離條帶的可辨性。因此，DGGE一般會(huì)在引物的5′端添加30 bp左右的GC夾子，同時(shí)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一般不低于 30個(gè)循環(huán)。DGGE方法中關(guān)于PCR條件的優(yōu)化有很多研究報(bào)道，但主要集中在PCR技術(shù)的選擇上［17-19，26］，如普通PCR、降落PCR、巢式PCR或其他技術(shù)改進(jìn)。這一方面與GC夾子的引入有關(guān)，一方面與擴(kuò)增產(chǎn)物的量必須達(dá)到相對(duì)較高的水平有關(guān)。

不論是利用高通量測(cè)序技術(shù)還是DGGE技術(shù)，在分析微生物的多樣性組成時(shí)，都涉及DNA樣品的PCR擴(kuò)增，即均需要對(duì)樣品進(jìn)行富集。一般情況下，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越少，越能反應(yīng)樣品的真實(shí)情況；但擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越少，能夠捕捉到的樣品信息也會(huì)越少。為了平衡樣品的真實(shí)性和信息的全面性，我們比較了20、25、30三個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)微生物群落組成的影響。從分析結(jié)果來(lái)看，無(wú)論是土壤樣品還是食糜樣品，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為25時(shí)，細(xì)菌的群落組成與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為20時(shí)的群落組成最接近，即最接近真實(shí)狀態(tài)，同時(shí)其在物種多樣性上較擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為20時(shí)的物種多樣性更高。如果要最大程度地反映樣品的真實(shí)性，可以選擇宏基因組測(cè)序技術(shù)［15，20-21］，即直接對(duì)環(huán)境樣品中的DNA進(jìn)行打斷和測(cè)序，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這樣在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，可以通過(guò)拼接 16S rDNA的全長(zhǎng)基因?qū)崿F(xiàn)微生物的種類鑒定。

REFERENCES

［1］ Wommack KE， Nasko DJ， Chopyk J， et al. Counts and sequences， observations that continue to change our understanding of viruses in nature. J M icrobiol， 2015， 53（3）: 181-192.

［2］ Secundo de Souza AI， Freitas Neto OC， Batista DF，et al. ERIC-PCR genotyping of field isolates of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum biovars Gallinarum and Pullorum. Avian Pathol， 2015， 44（6）: 1-20.

［3］ M o QH， Wang HB， Tan H， et al. Optim ization and head-to-head comparison of M ISSR-PCR，ERIC-PCR， RAPD and 16S rRNA evolutionary clock for the genotyping of Vibrio cholerae isolated in China. Indian J Med M icrobiol， 2015， 33（4）: 516-523.

［4］ Dewhirst FE， K lein EA， Bennett M L， et al. The feline oral m icrobiome: a provisional 16S rRNA gene based taxonomy w ith full-length reference sequences. Vet M icrobiol， 2015， 175（2/4）: 294-303.

［5］ Hotta F， Eguchi H， Naito T， et al. Achromobacter buckle infection diagnosed by a 16S rDNA clone library analysis: a case report. BMC Ophthalmol，2014， 14: 142-148.

［6］ Ren W， Zhao H， Shao W， et al. Identification of a novel phenamacril-resistance related gene by cDNA-RAPD method in Fusarium asiaticum. Pest M anag Sci， 2015.

［7］ Sadiq FA， Li Y， Liu T， et al. A RAPD based study revealing a previously unreported w ide range of mesophilic and thermophilic spore formers associated w ith m ilk powders in China. Int J Food M icrobiol， 2015， 217: 200-208.

［8］ Choi IW， Kim HY， Quan JH， et al. M onitoring of fasciola species contam ination in water dropwort by cox1 m itochondrial and ITS-2 rDNA sequencing analysis. Korean J Parasitol， 2015， 53（5）: 641-645.

［9］ Marques S， Huss VA， Pfisterer K， et al. Internal transcribed spacer sequence-based rapid molecular identification of Prototheca zopfii and Prototheca blaschkeae directly from milk of infected cows. J Dairy Sci， 2015， 98（5）: 3001-3009.

［10］ Flórez AB， Mayo B. Diversity and dynam ics of antibiotic-resistant bacteria in cheese as determ ined by PCR denaturing gradient gel electrophoresis. Int J Food M icrobiol， 2015， 214: 63-69.

［11］ El-Sayed WS1， Ouf SA2， Mohamed AA3. Deterioration to extinction of wastewater bacteria by non-thermal atmospheric pressure air plasma as assessed by 16S rDNA-DGGE fingerprinting. Front M icrobiol， 2015， 6: 1098-1110.

［12］ Xun W， Zhao J， Xue C， et al. Significant alteration of soil bacterial communities and organic carbon decomposition by different long-term fertilization management conditions of extremely low-productivity arable soil in South China. Environ M icrobiol， 2016， 18（6）: 1907-1917.

［13］ Jami E， Israel A， Kotser A， et al. Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood. ISME J， 2013， 7（6）: 1069-1079.

［14］ Kautz S， Rubin BE， Russell JA， et al. Surveying the microbiome of ants: comparing 454 pyrosequencing w ith traditional methods to uncover bacterial diversity. Appl Environ M icrobiol， 2013， 79（2）: 525-534.

［15］ Bulgarelli D， Garrido-Oter R， Münch PC， et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in w ild and domesticated barley. Cell Host M icrobe， 2015， 17（3）: 392-403.

［16］ Dassi E， Ballarini A， Covello G， et al. Enhanced m icrobial diversity in the saliva microbiome induced by short-term probiotic intake revealed by 16S rRNA sequencing on the IonTorrent PGM platform. J Biotechnol， 2014， 190: 30-39.

［17］ Yin QY， Guo XL， Zhao MQ， et al. Optim ization of V3 region PCR reaction system w ith soil m icrobial total DNA as template. J Henan Agricul Sci， 2012，41（1）: 65-68.

殷全玉， 郭夏麗， 趙銘欽， 等. 土壤微生物總DNA的V3可變區(qū)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012， 41（1）: 65-68.

［18］ Wang M J， Cao YS， Hu YX， et al. Investigating the bacterial diversity of chicken respiratory tract byPCR-DGGE. China Feed， 2013， 4（9）: 26-28.

汪夢(mèng)娟， 曹銀生， 胡艷霞， 等. 應(yīng)用 PCR-DGGE分析肉雞呼吸道中細(xì)菌多樣性. 中國(guó)飼料， 2013，4（9）: 26-28.

［19］ Jiang HY， Chen ZL， Zhao GH， et al. Investigating the diversity of lactic acid bacteria in Tibetan traditional fermented dairy products by PCR-DGGE. Food Science， 2014， 35（1）: 167-173.

蔣厚陽(yáng)， 陳芝蘭， 趙國(guó)華， 等. PCR-DGGE法分析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的多樣性. 食品科學(xué)， 2014， 35（1）: 167-173.

［20］ Bhatia S， Batra N， Pathak A， et al. Metagenom ic analysis of bacterial and archaeal assemblages in the soil-mousse surrounding a geothermal spring. Genom Data， 2015， 5: 195-200.

［21］ Karlsson FH， Tremaroli V， Nookaew I， et al. Gut metagenome in European women w ith normal，impaired and diabetic glucose control. Nature，2013， 498（7452）: 99-103.

［22］ Courtois S， Frosteg?rd A， G?ransson P， et al. Quantification of bacterial subgroups in soil: comparison of DNA extracted directly from soil or from cells previously released by density gradient centrifugation. Environ M icrobiol， 2001， 3（7）: 431-439.

［23］ Hurt RA， Qiu X， Wu L， et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl Environ M icrobiol， 2001， 67（10）: 4495-4503.

［24］ Fei N， Zhao L. An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germ free m ice. ISME J， 2013， 7（4）: 880-884.

［25］ Yin YY， Liu YJ， Zhu WY， et al. Effects of acarbose addition on ruminal bacterial m icrobiota，lipopolysaccharide levels and fermentation characteristics in vitro. Asian-Australas J Anim Sci，2014， 27（12）: 1726-1735.

［26］ Wang YF， Zhang FQ， Gu JD. Improvement of DGGE analysis by modifications of PCR protocols for analysis of m icrobial community members w ith low abundance. Appl M icrobiol Biotechnol， 2014，98（12）: 5655-5663.

（本文責(zé)編 陳宏宇）

Influence of PCR cycle number on microbial diversity analysis through next generation sequencing

Yunhe An1,2, Lijuan Gao1,2, Junbo Li1,2, Yanjie Tian1,2, Jinlong Wang1,2, Xuejuan Zheng1,2, and Huijuan Wu1,2

1 Beijing Center For Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China
2 Beijing Engineering Technique Research Center for Gene Sequencing & Function Analysis， Beijing 100094， China

Using of high throughput sequencing technology to study the microbial diversity in complex samples has become one of the hottest issues in the field of microbial diversity research. In this study， the soil and sheep rumen chymesamples were used to extract DNA， respectively. Then the 25 ng total DNA was used to amplify the 16S rRNA V3 region w ith 20， 25， 30 PCR cycles， and the final sequencing library was constructed by m ixing equal amounts of purified PCR products. Finally， the operational taxonom ic unit （OUT） amount， rarefaction curve， m icrobial number and species were compared through data analysis. It was found that at the same amount of DNA template， the proportion of the community composition was not the best w ith more numbers of PCR cycle， although the species number was much more. In all， when the PCR cycle number is 25， the number of species and proportion of the community composition were the most optimal both in soil or chyme samples.

October 23， 2015； Accepted: January 6， 2016

Huijuan Wu. Tel: +86-10-58711817； Fax: +86-10-58717638； E-mail: sunnywhj@126.com

PCR cycle number， high throughput sequencing， m icrobial diversity analysis

Supported by: Beijing Academy of Science and Technology 2015 Youth Backbone Project （No. 201522）.

北京市科學(xué)技術(shù)研究院2015年青年骨干項(xiàng)目 （No. 201522） 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-17 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160317.1018.001.html