管峰，金嘉長，趙華國，洪磊，沈志森，竺亞斌

1 寧波大學 醫(yī)學院，浙江 寧波 3152112 寧波大學 醫(yī)學院附屬李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315041

組織工程與細胞培養(yǎng)

海豚鏈球菌誘變發(fā)酵法制備透明質酸及其在動物皮膚修復中的應用

管峰1，金嘉長1，趙華國1，洪磊1，沈志森2，竺亞斌1

1 寧波大學 醫(yī)學院，浙江 寧波 315211
2 寧波大學 醫(yī)學院附屬李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315041

管峰， 金嘉長， 趙華國， 等. 海豚鏈球菌誘變發(fā)酵法制備透明質酸及其在動物皮膚修復中的應用. 生物工程學報，2016， 32（8）: 1104-1114.

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透明質酸 （HA） 是一種非常重要的生物材料，是體內廣泛存在的細胞外基質成分之一。為了獲得產量、分子量及純度較高的透明質酸，并研究透明質酸水凝膠在動物皮膚修復中的潛在作用。通過紫外誘變的方法對海豚鏈球菌進行誘變，并對此突變菌發(fā)酵后產物的蛋白含量及HA分子量進行了測定，通過CTAB法對發(fā)酵產物進行提純，運用物理凍融法將透明質酸制成水凝膠后，用于兔背部全層皮膚修復的初探。結果表明通過誘變海豚鏈球菌產透明質酸的能力從 （82.3±3.3） mg/L增加到 （120±10.6） mg/L，增加了46.4%；產物經純化后蛋白含量從 （0.178±0.011） mg/L減少到 （0.032±0.017） mg/L，減少了82.02%；所制得透明質酸的分子量約為3.0×105Da；透明質酸水凝膠對兔全層皮膚缺損的修復有較明顯的促進作用，能減輕炎癥和傷口瘢痕的形成。

海豚鏈球菌，發(fā)酵，透明質酸，皮膚修復

透明質酸 （Hyaluronic acid，HA） 是一種非常重要的直鏈聚陰離子粘多糖，由 （1→4）-β-D-葡萄糖醛酸及 （1→3）-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復單位組成［1］，其結構式如圖1所示［2］。1934年由美國哥倫比亞大學眼科教授Meyer和Palmer在牛眼晶狀體中發(fā)現(xiàn)［3］。HA在體內分布廣泛，在關節(jié)滑液、皮膚、臍帶、腦、軟骨等組織中均有分布，是大多數(shù)結締組織中主要的細胞外基質成分。HA除了具有生物可吸收性、生物相容性、黏稠性、保水性和促進創(chuàng)傷愈合等重要特性，更重要的是其無抗原性、無過敏性、通常不發(fā)生免疫反應，因此，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域得到廣泛開發(fā)和應用。而隨著對 HA功能越來越深入的研究，其在組織工程和再生醫(yī)學方面的應用也越來越受到關注，如在外科手術防黏劑、藥物遞送系統(tǒng)、癌癥治療、眼科、整容外科等領域已開始得到研究和開發(fā)［4-11］。

圖1　透明質酸的結構式[2]Fig. 1 The structure scheme of hyaluronic acid［2］.

透明質酸的生產方法有動物組織提取法和微生物發(fā)酵法，前者由于效率低、成本高、原料來源有限及來源組織的安全性等問題，已逐漸被微生物發(fā)酵法所取代。微生物發(fā)酵生產HA 于1983年被首次報道后［12］，由于其克服了動物組織提取法所存在的缺點而得到廣泛的關注和研究，目前發(fā)酵法已成為規(guī)?；aHA的主要方法，文獻所報道的發(fā)酵法中所采用的菌株主要為獸疫鏈球菌和馬疫鏈球菌，缺乳鏈球菌、糞馬鏈球菌及雞霍亂桿菌等也有少量報道［13-15］。

海豚鏈球菌 （Streptococcus iniae， Strep.） 最初是從一例皮膚潰瘍的亞馬遜淡水河豚中分離得到的。它屬兼性厭氧菌，大多呈β溶血活性，最佳生長溫度為 37 ℃，10-45 ℃可生長［16］。據(jù)文獻［12］報道，大多數(shù)鏈球菌在培養(yǎng)初期可見到微莢膜，內含有透明質酸，因為微莢膜對于細菌來說具有抗吞噬的作用，有利于細菌侵襲宿主。因此，本文對從海豚鏈球菌發(fā)酵產物中透明質酸的提取進行了研究，這在現(xiàn)有的文獻上還未見過報道。另外，為了提高HA的產量，對海豚鏈球菌進行了紫外誘變及最佳培養(yǎng)基的篩選，在此基礎上，對由 HA做成的凝膠進行了動物全層皮膚缺損的修復初探。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本實驗所用海豚鏈球菌 （Streptococcus iniae，Strep.） 由寧波大學海洋學院提供，從美國羅非魚中分離得到，并進行了 16S rRNA 的PCR鑒定。購自山東福瑞達公司的透明質酸 （分子量1 800 000 Da） 作為對照。十六烷基三甲基溴化銨 （CTAB，aladdin），腦-心浸出液肉湯（BHI，廣州環(huán)凱），葡萄糖、七水硫酸鎂、NaCl、乙醇、醋酸鈉、乙酸、磷酸二氫鉀、瓊脂糖 （國藥），酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨 （HANGWEI，杭州），十二烷基硫酸鈉 （SDS，Solarbio）。

1.2培養(yǎng)基

BHI為粉末狀，成分 （100 m L） 為胰蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鈉0.25 g、葡萄糖0.2 g和牛心浸出液50 m L，pH 7.4。使用時稱取3.7 g溶于100 m L超純水，pH 7.4，121 ℃高壓滅菌 30 m in。在上述 BHI液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂糖，即得 BHI固體培養(yǎng)基，然后121 ℃高壓滅菌30 m in備用。

葡萄糖培養(yǎng)基由葡萄糖2 g、酵母浸膏2 g、牛肉浸膏2 g、蛋白胨1 g、七水硫酸鎂0.2 g和磷酸二氫鉀0.2 g組成，加100 m L超純水溶解，調pH至7.4，121 ℃高壓滅菌30 m in備用。

將上述液體BHI和葡萄糖培養(yǎng)基按一定比例混合即得混合培養(yǎng)基，本實驗中BHI和葡萄糖培養(yǎng)基的比例設為0∶1，1∶0，1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1等7種。

1.3海豚鏈球菌發(fā)酵產物的粗提和純化

經Strep.菌發(fā)酵15 h后往發(fā)酵液中加入與發(fā)酵液等體積的0.1%十二烷基硫酸鈉 （SDS，W/V），攪勻，室溫靜置10 m in，離心10 min （7 000 r/m in），取上清，加入兩倍體積的乙醇，4 ℃過夜，然后4 ℃下離心18 m in （7 000 r/m in），得到的沉淀用乙醇鹽溶液 （75%乙醇、25% 的0.15 mol/L NaCl）洗滌、離心3次，每次2 m in （10 000 r/min），最后將沉淀干燥，即得發(fā)酵粗產物［17］。

對發(fā)酵產物的純化采用“CTAB法”［18-19］。在發(fā)酵初產物中加入0.1% SDS，靜置10 m in后離心，取上清，加入一定量的CTAB （10%，W/W） 溶液，攪拌，靜置15 m in，離心得沉淀；加入NaCl溶液 （0.2 mol/L） 攪拌，然后離心得上清液，在上清液中加入兩倍體積乙醇，離心得到沉淀。最后，用乙醇鹽溶液洗滌、離心3次，得到沉淀，室溫下干燥。上述離心條件均為 2 m in，10 000 r/min。干燥后的HA，用于紅外表征及分子量的測定［18］。

1.4發(fā)酵產物中HA濃度的測定

HA濃度的測定采用改良的CTAB比濁法［20］，以標準HA配制濃度分別為0、20、40、60、80 及100 mg/L的標準溶液，測定400 nm處的吸光度，制作標準曲線。將上述純化的發(fā)酵產物用超純水溶解，取150 μL置于2 m L EP管，加入350 μL醋酸緩沖液 （0.2 mol/L醋酸鈉，0.15 mol/L氯化鈉，用乙酸調節(jié) pH至6.0），最后加入1 m L CTAB溶液，混勻，室溫靜置10-15 m in，于400 nm波長下測定吸光度值。根據(jù)標準曲線推算出發(fā)酵產物中HA的濃度。

1.5發(fā)酵產物中蛋白質含量的測定及蛋白去除率的計算

BCA試劑盒由康為世紀公司 （Cat:CW 0014）提供，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，先制作標準曲線，得到標準方程，根據(jù)樣品的吸光度值計算出所測溶液的蛋白質濃度。

蛋白去除率為純化前蛋白含量 （P0） 與純化后蛋白含量 （P1） 的差值比上P0，即去除率= （P0-P1）/P0。

1.6HA分子量測定

1.7海豚鏈球菌的紫外誘變

取少量處于對數(shù)生長期的海豚鏈球菌 Strep.均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，紫外 （U ltraviolet，UV） 燈照射一定時間，根據(jù)不同照射時間的致死率，選擇致死率在 90%以上的照射時間作為紫外誘變的最佳時間，然后挑取若干單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，再擴大培養(yǎng)，然后對發(fā)酵液進行HA的提取、純化、HA含量和蛋白含量以及分子量測定，與未誘變的菌株比較，篩選產量明顯提高的菌株。紫外燈的功率為20 W，照射距離為30 cm，致死率的計算為不同照射時間下的菌落數(shù) （N1） 與未照射下的菌落數(shù) （N0） 之差，除以N0所得，即致死率=（N1-N0）/N0×100%。

1.8培養(yǎng)基的優(yōu)化

將 BHI培養(yǎng)基 （B） 與葡萄糖培養(yǎng)基 （G）按不同的比例混合，觀察菌體的生長狀況，實驗中按B∶G=0∶1，1∶0，1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1共7種比例混合，然后將活化后的菌種按 1∶100的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，28-30 ℃、150 r/min培養(yǎng)15 h以上，停止培養(yǎng)，取 500 μL混勻后的菌液，8 000 r/m in離心10 m in，吸去上清，再加入500 μL PBS重懸，取200 μL測吸光度 （波長600 nm），用于確定不同培養(yǎng)基下菌體的生物量。每種比例培養(yǎng)基重復培養(yǎng)3次，得到平均結果。

1.9透明質酸應用于兔子皮膚修復

運用物理凍法將透明質酸粉末制備成 HA水凝膠［22］。將上述制備的 HA水凝膠承載于無菌無紡布上。HA濃度為16 mg/m L，每張無紡布上的水凝膠用量為3 m L。以新西蘭大白兔為實驗動物，將兔子背部人為造成3.5 cm×3.5 cm的全層皮膚缺損，缺損皮厚度約為1.5 mm。實驗兔分為二組共20只，一組常規(guī)消毒，紗布覆蓋 （對照組）；另一組酒精消毒后以上述HA水凝膠覆蓋傷口 （HA組），2 d換一次凝膠，5 d后拆掉覆蓋層。觀察傷口外觀、傷口尺寸隨時間變化、傷口周圍炎癥情況及血液中的白細胞（White blood cell，WBC） 變化情況。

1.10統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的分析采用 t檢驗，P＜0.05時，差異具有顯著性。應用Graphpad Prism 6.0及SPSS 22.0 軟件進行分析。

2　結果與分析

2.1海豚鏈球菌的生長曲線

Strep. 在14 h的培養(yǎng)周期中其生長曲線如圖2所示，從圖中可以看出，0-6 h為該菌的生長適應期，6-10 h為該菌的對數(shù)生長期，10 h以后該菌即進入穩(wěn)定期。對于發(fā)酵產物的提取，在鏈球菌進入穩(wěn)定期后其自身的透明質酸酶會分解透明質酸，而且進入穩(wěn)定期后其產透明質酸的能力也有所減弱，因此，我們在發(fā)酵培養(yǎng)11-13 h后，即進行透明質酸的提取；對于鏈球菌的紫外誘變，一般在對數(shù)生長的后期比較適宜，因此，我們選擇在發(fā)酵培養(yǎng)9-10 h后進行紫外誘變。

2.2海豚鏈球菌的紫外誘變及培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1紫外誘變

海豚鏈球菌在相同紫外燈功率下，照射不同時間后的致死率如圖3所示，在0、5、30、60 和120 s共5個時間點內，在照射時間為5 s時，已有近50%以上的鏈球菌死亡，30 s時，死亡率已達到90%以上，60 s以上，鏈球菌的死亡率已接近100%。因此，實驗中我們采用紫外照射時間35 s作為紫外誘變時間。

圖2　海豚鏈球菌的生長曲線Fig. 2 The grow th curve of Streptococcus iniae as a function of time.

圖3　海豚鏈球菌的紫外誘變致死率曲線Fig. 3 The mortality of Streptococcus iniae under UV treatment as a function of time.

對第一次紫外誘變后的菌株進行篩選，得到透明質酸產量略高的菌株，將該菌株再重復誘變一次，得到的菌株其產量比未誘變的Strep.提高達 46.4% （從 （82.3±3.3） mg/L增加到（120±10.6） mg/L），結果如圖4所示。

2.2.2培養(yǎng)基的優(yōu)化

在 7種不同的培養(yǎng)基中，BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鏈球菌其吸光度值比在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鏈球菌高很多，說明鏈球菌在普通葡萄糖培養(yǎng)基中很難生長，或生長緩慢，甚至不生長，而當在葡萄糖培養(yǎng)基中加入BHI后其生長明顯加快，菌體量明顯增多，且隨著BHI比例的增加，其菌體量隨之增高，在BG5.5 （即BHI∶葡萄糖培養(yǎng)基=5∶3） 之前，混合培養(yǎng)基中的菌體量少于BHI培養(yǎng)基中的菌體量，而在BG7.3之后 （包括 BG7.3） 混合培養(yǎng)基中菌體量則比純BHI培養(yǎng)基中的菌體量多，且差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），如圖5所示。說明BHI中一定量的葡萄糖培養(yǎng)基有助于鏈球菌的生長。

圖4　海豚鏈球菌2次紫外誘變后的HA產量變化Fig. 4 The variation of HA's yield of Streptococcus iniae after two times of UV mutation.

圖5　海豚鏈球菌在不同培養(yǎng)基配比下的吸光度Fig. 5 Absorbance of Streptococcus iniae （at 600 nm）w ith a variety of culture media of different ratio of BHI to glucose medium. In picture， BG0.1 stands for the ratio of BHI medium to glucose medium （B:G）=0:1； so are others.

發(fā)酵產物純化的目的主要是去除產物中的蛋白質成分，本文采用CTAB法［18-19］純化HA，純化后產物的蛋白含量從 （0.178±0.011） mg/L降低到 （0.032±0.017） mg/L，如圖6所示（P＜0.05），蛋白去除率達82.02%，純化的效率為88.32%，比文獻［19］報道的略低。對純化后的HA采用烏氏粘度法進行分子量的測定，得到其分子量約為3×105Da。

圖6　HA純化前后蛋白含量的變化Fig. 6 The variation of protein content before and after HA purification.

2.3FTIR表征

海豚鏈球菌發(fā)酵產物經純化后，充分干燥，以溴化鉀壓片，利用紅外光譜儀 （Thermo，美國） 進行FTIR吸收光譜測試 （掃描范圍4 000-400 cm-1）。得到的紅外吸收光譜與HA標準品進行比較，從圖7可以看出，海豚鏈球菌發(fā)酵產物中HA的吸收峰 （A） 與HA標準品的吸收峰 （B） 基本一致，在3 400 cm-1附近有很強的O-H伸縮振動的特征吸收，說明存在多羥基結構；在2 920 cm-1附近有-CH2的伸縮振動；在1 560-1 620 cm-1附近有CO-、CN-的伸縮振動，說明存在酰胺基結構；1 420 cm-1處為羧基中O-H的伸縮振動，以上的特征吸收峰可以表明Streptococcus iniae發(fā)酵產物經純化后得到的主要為HA，其含有的多糖羥基、乙酰氨基及羥羧基結構，與 HA重復單位中的乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸一致。綜上所述，采用Streptococcus iniae誘變發(fā)酵法可以作為HA的微生物發(fā)酵制備的菌株。

2.4HA 水凝膠在皮膚修復中的作用初探

圖7　透明質酸的FTIR曲線Fig. 7 FTIR curve of hyaluronic acid. A: HA fabricated from Strep. Fermentation； B: standard HA.

圖8　兔子背部全層皮膚修復觀察Fig. 8 Overview of wound skin repairing on rabbit's back. a: control group； b: HA group.1: day 0 post-operation； 2: day 5 post-operation； 3: day 18 post-operation； 4: day 27 post-operation； 5: day 40 post-operation.

兔子背部傷口分別經臨床上常規(guī)紗布包覆和采用 HA水凝膠包覆后傷口修復的外觀觀察情況如圖6所示，18 d和27 d時其傷口的修復情況均明顯好于對照 （無凝膠） 組。HA組與對照組的傷口在手術后2 d均是濕潤的，凝膠及無紡布上都有血跡，傷口有紅腫，HA組比對照組略輕；在術后 5 d左右二組均有一定程度的化膿，傷口周圍紅腫但比 2 d時減輕，相對而言HA組化膿情況輕微，紅腫不如對照組明顯，傷口周圍已部分結痂；5 d后傷口均慢慢縮小，整個傷口部分均結痂變硬；到18 d和27 d時，二組的傷口情況已發(fā)生明顯差異 （圖8和圖9），結痂變硬的部分有所脫落，但瘢痕仍明顯，至40 d時傷口幾乎完全愈合，留下一個很小的無毛發(fā)區(qū)。

對實驗兔進行血液白細胞檢查，結果如圖10所示。術后6 d前，白細胞值總體呈上升趨勢，對照組 （Ctrl） 的白細胞上升趨勢尤其明顯，而 HA組變化不明顯。通常手術一周內傷口易發(fā)生炎癥，體現(xiàn)在血液中白細胞量增加，這也說明HA有助于降低傷口炎癥的發(fā)生。6 d后，兩組白細胞值總體呈下降趨勢，說明此時兔子傷口炎癥已較輕微；到20 d左右，基本與術前一致，也即在傷口處基本已無炎癥。相比而言，HA組的總體炎癥情況明顯低于對照組，這對傷口的修復是非常有利的。

圖9　傷口面積的大小變化 (cm2)，第18及27天時，Ctrl及HA組的傷口面積差異有顯著性 (P<0.05)Fig. 9 The variation of area of scars （cm2）， the area of scars of Ctrl and HA groups are different significantly at the 18thand 27thdays （P＜0.05）.

圖10　術后20 d內對照組與HA組血液中白細胞相對含量的變化Fig. 10 Relative values of WBC in blood of Ctrl and HA groups in 20 days post-operation.

3　討論

早在1937年Kendall等［23］就在溶血性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)并提取了透明質酸，之后許多科學家及研究者對菌種及發(fā)酵提取方法做了眾多改進，獲得了無溶血性、透明質酸酶缺陷及透明質酸產量較高的菌株，形成了多種較好的發(fā)酵及分離純化方法，使產物提取效率增大、雜質含量減少以及分子量提高。但這些研究所使用的菌株主要為獸疫鏈球菌或馬疫鏈球菌等，本實驗室所用的海豚鏈球菌是從美國羅非魚中分離得到的，為革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，呈β溶血。其微莢膜主要是由透明質酸組成，并且能一定程度地向培養(yǎng)基中分泌透明質酸，目前還未有從海豚鏈球菌中提取透明質酸的報道，我們的研究表明該海豚鏈球菌 Streptococcus iniae，尤其在紫外誘變后可以作為透明質酸的發(fā)酵菌株。

國內外報道的關于 HA菌株的誘變劑主要有紫外線、γ射線、亞硝基胍等［24］，它們對菌株產生突變的作用方式有所不同，亞硝基胍等主要是引起堿基對置換，得到的突變株回復突變率較高，而紫外線、γ射線等則引起堿基對缺失、編碼框移位等較大的遺傳物質損傷，使回復突變率較低［25］。除了能產生相對穩(wěn)定的突變株，紫外線和 γ射線還具有相對安全、無毒及無污染等優(yōu)點。因此在海豚鏈球菌的篩選中，我們使用更方便、設備要求更低的紫外誘變方法，通過紫外誘變，我們得到了產量比未突變株有所提高的菌株。但是與獸疫鏈球等成熟的發(fā)酵菌株相比，海豚鏈球菌發(fā)酵的 HA在產量、分子量及純度方面還是有很大不足［26-30］。不過，目前我們對于海豚鏈球菌發(fā)酵生產 HA的研究才剛剛開始，今后將在提高 HA產量、分子量及純度上進行更深入的研究。

海豚鏈球菌對于培養(yǎng)基的要求非常高，基本上只在BHI培養(yǎng)基或含有腦心浸出液的培養(yǎng)基中能較好生長。在相同的培養(yǎng)條件下，海豚鏈球菌的生長速度比獸疫鏈球菌慢，尤其是在有氧條件下。但是從我們的實驗結果看在 BHI培養(yǎng)基中加入一定量的葡萄糖培養(yǎng)基有助于海豚鏈球菌的生長，比在單獨BHI培養(yǎng)基的生長情況要好。說明葡萄糖培養(yǎng)基或葡萄糖培養(yǎng)基中的某些成分在BHI培養(yǎng)基中的含量對海豚鏈球菌的生長有促進作用。這個問題還將在今后的研究中逐步深入。

透明質酸應用于皮膚修復的研究已有報道，如直接將 HA粉末應用于傷口［31-32］，或者將 HA與其他成分如生長因子等混合應用于傷口［31，33］。我們采用將透明質酸制成水凝膠，在未加任何生長因子的情況下用于動物全層皮膚缺損的修復，初步研究已發(fā)現(xiàn)其明顯的降低炎癥、提高傷口收口速度、以及疤痕程度減輕等優(yōu)點。這些優(yōu)點可能跟 HA水凝膠在動物體內的降解有關。HA在體內的降解吸收速度決定于其分子量的大小，分子量大降解吸收慢，相反分子量小降解吸收快，當小分子量的 HA形成三維網絡結構的凝膠后，其在體內的降解吸收速度也會變慢，因此等量的 HA在凝膠狀態(tài)比在單體狀態(tài) （如 HA粉末） 在體內存在時間更長，發(fā)揮效用的時間也因此延長，這也是為什么我們要將 HA單體制成凝膠后應用于動物皮膚修復的原因。

4　結論

我們發(fā)現(xiàn)了一種新的有望作為透明質酸生產菌的鏈球菌——海豚鏈球菌 Streptococcus iniae，經過紫外誘變后獲得了一株產量較高的突變株，相比原始菌株其產量提高達 46%，該海豚鏈球菌在有氧和無氧條件下均能產生透明質酸，但在無氧條件下略高。另一方面，Streptococcus iniae對培養(yǎng)基的要求比較高，需要牛心浸出液等成分才能很好的生長，在一般葡萄糖、蛋白胨培養(yǎng)基中生長非常緩慢，我們經過篩選發(fā)現(xiàn)在BHI培養(yǎng)基中混合少量葡萄糖培養(yǎng)基，有利于其生長。

將透明質酸采用物理方法 （即不加其他成分） 制成水凝膠后對兔子背部全層皮膚的修復具有明顯的促進作用，表現(xiàn)在減輕傷口及全身的炎癥反應、減少瘢痕的形成等。對于 HA用于皮膚修復更詳細的研究仍在進行中，將會在后續(xù)工作中報道。由于在 HA轉變成水凝膠的過程中沒有添加其他成分，保證了其應用的安全性，也有助于今后在臨床上進行推廣。

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（本文責編 陳宏宇）

December 9， 2015； Accepted: March 17， 2016

Yabin Zhu. Tel: +86-574-87609592； E-mail: zhuyabin@nbu.edu.cn

Hyaluronic acid production by Streptococcus iniae and its app lication in rabbit skin’s regeneration

Feng Guan1, Jiachang Jin1, Huaguo Zhao1, Lei Hong1, Zhisen Shen2, and Yabin Zhu1

1 The Medical School， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China
2 The Lihuili Hospital Affiliated to the Medical School， Ningbo University， Ningbo 315041， Zhejiang， China

Hyaluronic acid （HA） is an important biomaterial as the extracellular matrix in human body. We produced HA by fermentation of Streptococcus iniae （Strep.）. Production of HA by Strep. was evaluated and further improved by strain mutation by ultraviolet. One strain w ith higher HA yield and lower content of protein was obtained. Its HA yield increased from （82.3±3.3） mg/L to （120±10.6） mg/L， and protein decreased from （0.178±0.011） mg/L to （0.032±0.017） mg/L. The molecular weight （MW） of HA yield from Strep. is about 3.0×105Da. Using the method of freezing and thaw ing， HA aqueous solution was transferred into hydrogel. This HA hydrogel， casted on sterilized non-woven fabric， was applied to repair rabbit skin w ith full-thickness defect. The prelim inary results of the animal tests displayed that HA hydrogel obviously reduced the inflammation around the wound and promoted the skin regeneration comparing w ith the control tests.

Streptococcus iniae， fermentation， hyaluronic acid， skin regeneration

Supported by: National Natural Science Foundation of China （Nos. 81171476， 81471797）， Project of Scientific Innovation Team of Ningbo （Nos. 2015B11050， 2012C5015）.

國家自然科學基金 （Nos. 81171476， 81471797），寧波科技創(chuàng)新團隊項目 （Nos. 2015B11050， 2012C5015） 資助。