張一凡 王麗君 黨鳳強(qiáng) 齊麗梅 徐越 孫晶 郎明非 謝蓮娜

急性心肌梗死患者循環(huán)miR-208b-3p診斷價(jià)值的研究

張一凡 王麗君 黨鳳強(qiáng) 齊麗梅 徐越 孫晶 郎明非 謝蓮娜

目的 探討急性心肌梗死患者循環(huán)miR-208b-3p與健康人的表達(dá)是否具有差異，及其在不同亞組中的診斷價(jià)值。方法 收集140例大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管內(nèi)科2012年5月至2014年8月確診為急性心肌梗死（AMI）患者入院即刻血漿樣本和19例健康人（HC）血漿樣本。特異莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)樣本miR-208b-3p的表達(dá)水平，并與超敏肌鈣蛋白I（hs-TnI）和肌酸激酶-同工酶（CKMB）進(jìn)行對(duì)比分析。qRT-PCR檢測(cè)ST段抬高型心肌梗死（STEMI）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者血漿miR-208b-3p表達(dá)水平，ROC曲線評(píng)估診斷價(jià)值。結(jié)果 AMI組和HC組血漿miR-208b-3p的表達(dá)量分別為 43.86±7.50和 2.05±0.62，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miR-208b-3p與 CK-MB 呈明顯正相關(guān)（r=0.546，P＜0.01），miR-208b-3p、CK-MB 和 hs-TnI ROC 曲線下面積（AUC）分別是 0.874（P＜0.01）、0.976（P＜0.01）和 0.971（P＜0.01）；STEMI亞組和 NSTEMI亞組血漿 miR-208b-3p 表達(dá)量分別為 55.04±10.44 和 21.01±7.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AUC 分別為 0.935（P＜0.01）和 0.749（P＜0.01）。結(jié)論 循環(huán) miR-208b-3p可作為AMI患者的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，但不優(yōu)于hs-TnI和CK-MB；循環(huán)miR-208b-3p對(duì)于STEMI亞組的診斷敏感度和特異度高于NSTEMI亞組。

急性心肌梗死；循環(huán)miRNAs；miR-208b；診斷

MiRNA是一種由 19～24個(gè)核苷酸（nt）組成的微小RNA片段，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1,2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可穩(wěn)定存在于人類(lèi)外周血中，并在腫瘤、肌肉損傷、炎癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[3]，此外對(duì)心臟發(fā)育也發(fā)揮精細(xì)的調(diào)控作用[4]。但對(duì)AMI亞組循環(huán)miRNAs的研究較少。本研究采用qRT-PCR方法對(duì)ST段抬高型心肌梗死（STEMI）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者循環(huán)miR-208b-3p表達(dá)水平進(jìn)行定量測(cè)定，了解不同人群的表達(dá)水平，探究其早期診斷AMI的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 入選對(duì)象及分組 選擇140例大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管內(nèi)科2012年5月至2014年8月確診為AMI的患者，其中STEMI組94例、NSTEMI組46例；HC組19例均為健康體檢人群，無(wú)心電圖異常表現(xiàn)及心血管疾病。所有入選者均經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書(shū)。

AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)參照最新版“心肌梗死全球統(tǒng)一定義”的AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。入選患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性感染的肝臟疾??；②急慢性腎臟疾病及其導(dǎo)致的腎功能不全；③血液系統(tǒng)疾病；④腫瘤性疾病；⑤肌肉損傷及嚴(yán)重的心功能不全等。另外要求采血前患者未使用抗凝劑，標(biāo)本無(wú)明顯溶血，EDTA管收集。

1.2 AMI患者血漿miRNA的檢測(cè)

1.2.1 AMI患者血漿分離及儲(chǔ)存 EDTA-K2抗凝管采集符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象全血2～4 ml，所有入選患者標(biāo)本均為急診入院即刻采血，并在4 h內(nèi)處理完畢。另外收集19例健康人血液標(biāo)本作為對(duì)照。所有標(biāo)本2000×g，4℃離心15 min，吸取上清血漿至新的EP管中，將血漿分裝在兩個(gè)1.5 ml EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿總RNA提取 血漿標(biāo)本置于冰上待完全融化。取250 μl血漿樣本并與750 μl Trizol LS（Life Technologies，美國(guó)）充分混勻。室溫孵化10 min后加入5 nM人工合成線蟲(chóng)miRNA-39-3p（celmiR-39-3p）5 μl，上下顛倒混勻，作為外參。然后向EP管中加入250 μl氯仿，劇烈震蕩20 s，室溫靜置15 min后13 000×g，4℃離心15 min。此時(shí)可見(jiàn)管中液體分為三層，RNA只存在于上層清液中，小心吸取上層清液。每個(gè)樣本加入20 mg/ml無(wú)酶Glycogen 0.5 μl混勻助沉，再加入 500 μl異丙醇混勻，置冰上孵化 10 min后，13 000×g，4 ℃離心 10 min。去除EP管上層懸液，僅留下RNA小球，加入1 ml配置好的無(wú)酶75%乙醇混勻，7500×g，4℃離心5 min。棄去上清，室溫干燥10 min，加入20 μl DEPC水，吹打均勻，57℃水浴孵化10 min。

提取總RAN后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；NanoQuant酶標(biāo)儀（瑞士TECAN集團(tuán)公司）檢測(cè)RNA純度，RNA純度=OD260/OD280，該比值應(yīng)在1.8～2.0。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物公司，大連）說(shuō)明制備20 μl反應(yīng)體系，使用東勝龍PCR儀ETC811（蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：42 ℃，15 min；85 ℃，5 s。本試驗(yàn)采用特異頸環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄法制備cDNA，miR-208b-3p（MIMAT0004960）反轉(zhuǎn)錄引物及qPCR上下游引物均由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)。提取的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血漿miRNA的檢測(cè) 使用CFX Connect熒光定量PCR儀（BIO-RAD，美國(guó)）按照miRNA sqPCR擴(kuò)增試劑盒（寶生物公司）說(shuō)明書(shū)制備反應(yīng)體系及qPCR檢測(cè)，檢測(cè)血漿miR-208b-3p表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算血漿miR-208b-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 ACS患者臨床生化指標(biāo)檢測(cè) 本試驗(yàn)所有患者臨床生化指標(biāo)均由我院檢驗(yàn)科檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPadPrism v6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。定量資料用±s表示，兩組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布行t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布的行方差分析，對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)分析分析相關(guān)性；ROC曲線及曲線下面積（AUC）評(píng)估診斷準(zhǔn)確性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般臨床資料 AMI組與HC組相比，兩組在年齡、性別、是否患有糖尿病、收縮壓及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等方面未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而在是否吸煙、是否患有高血壓、舒張壓及超敏肌鈣蛋白I（hs-TnI）等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。STEMI組與NSTEMI組相比，兩組僅在年齡、超敏肌鈣蛋白I（hs-TnI）、總膽固醇及肌酸激酶-同工酶（CK-MB）方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組患者血漿miR-208b-3p表達(dá)水平變化心臟富集循環(huán)血漿miR-208b-3p在各組均可測(cè)得。AMI組患者血漿miR-208b-3p表達(dá)水平顯著高于HC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AMI組和HC組血漿miR-208b-3p的表達(dá)量分別為43.86±7.50 和 2.05±0.62（圖 1A）；此外，STEMI亞組血漿miR-208b-3p表達(dá)水平也顯著高于NSTEMI亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表達(dá)量分別為 55.04±10.44 和 21.01±7.13（圖 1B）。

表1 各組研究對(duì)象一般臨床資料比較［±s，例數(shù)及百分率（%）］

表1 各組研究對(duì)象一般臨床資料比較［±s，例數(shù)及百分率（%）］

注：HC:健康對(duì)照；AMI：急性心肌梗死；NSTEMI：非ST段抬高性心肌梗死；STEMI：ST段抬高性心肌梗死；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；hs-TnI：超敏肌鈣蛋白 I；CK-MB：肌酸激酶-同工酶；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白；Cr：肌酐；ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；NT-proBNP：B 型氨基端利鈉肽原。與 HC 組相比，aP＜0.01，bP＜0.05；與 NSTEMI相比，cP＜0.05，dP＜0.01

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2.3 血漿miR-208b-3p表達(dá)水平與hs-TnI及CK-MB的關(guān)系 AMI組患者血漿miR-208b-3p表達(dá)水平與CK-MB水平呈正相關(guān)（圖2）。Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-208b-3p與CK-MB呈明顯正相關(guān)（r=0.546，P＜0.01）。ROC 曲線分析血漿miR-208b-3p與hs-TnI和CK-MB診斷準(zhǔn)確性（圖3），曲線下面積（AUC）分別是 0.874（95%CI 0.802～0.946，P ＜0.01）、0.971 （95%CI 0.940 ～1.001，P ＜0.01）和 0.976（95%CI 0.947～1.004，P＜0.01）。結(jié)果顯示，miR-208b-3p的曲線下面積具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均小于hs-TnI及CK-MB的曲線下面積。

2.4 AMI各亞組miR-208b-3p的診斷準(zhǔn)確性 通過(guò)ROC曲線對(duì)NSTEMI亞組和STEMI亞組miR-208b-3p的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，STEMI亞組和NSTEMI亞組的曲線下面積（AUC）分別為0.935（95%CI 0.877～0.992，P＜0.01） 和 0.749（95%CI 0.626～0.873，P＜0.01）。結(jié)果顯示，NSTEMI亞組和STEMI亞組曲線下面積均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但STEMI亞組曲線下面積大于NSTEMI亞組（圖4）。

3 討論

隨著cTns在臨床中被廣泛應(yīng)用，逐漸發(fā)現(xiàn)在AMI早期（＜4 h）用普通方法檢測(cè)cTns時(shí)，血清cTns診斷不是很敏感[6]，且有研究顯示，無(wú)心肌損傷的終末期腎病患者血漿中cTns含量也明顯升高，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)[7]；而高敏感度cTnT在慢性穩(wěn)定型冠心病和部分健康人群中也會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性情況，這也體現(xiàn)出hs-cTnI仍有一定局限性。

盡管有很多研究顯示，心臟富集miRNA與心肌損傷有關(guān)[8-11]，但最近的一項(xiàng)研究指出，這些miRNA由心肌細(xì)胞釋放[12]。其中miR-208被稱(chēng)為肌源性miRNA，在心肌組織中高表達(dá)，而在其他組織中基本不表達(dá)[13]，故也有心臟特異性miRNA之稱(chēng)。MiR-208是由2個(gè)成員構(gòu)成的高度保守miRNA家族，為miR-208a和miR-208b，分別位于Myh6和Myh7基因[14]。

有研究指出，miR-208a和miR-208b在心臟中高表達(dá)[15]，其中90%的AMI患者血漿中可檢測(cè)到升高，對(duì)應(yīng)的在89%的健康人群中檢測(cè)不到[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AMI組患者血漿miR-208b-3p較HC組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A），并通過(guò)相關(guān)性分析指出miR-208b-3p與CK-MB呈正相關(guān)。但ROC曲線及曲線下面積表明，雖然miR-208b-3p對(duì)AMI有一定的早期診斷敏感性和特異性，但與hs-TnI和CK-MB相比，miR-208b-3p的診斷價(jià)值并不優(yōu)于hs-TnI和CK-MB。

以往的研究主要集中在AMI患者與不穩(wěn)定心絞痛患者血漿miR-208b表達(dá)水平的對(duì)比，卻很少對(duì)AMI患者不同亞組之間進(jìn)行分析比較。本研究通過(guò)分析STEMI亞組患者和NSTEMI亞組患者血漿miR-208b-3p的表達(dá)水平，指出血漿miR-208b-3p在STEMI亞組的表達(dá)水平高于NSTEMI亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。并通過(guò)ROC曲線分析得出miR-280b-3p在STEMI亞組的診斷特異度和敏感度高于NSTEMI亞組。

本研究也有不足之處。首先樣本含量較小，使本研究有一定的局限性；其次沒(méi)有對(duì)穩(wěn)定型心絞痛患者和心力衰竭患者進(jìn)行綜合分析，研究有待進(jìn)一步深入。綜上所述，還需大樣本和規(guī)范化的研究對(duì)循環(huán)miRNAs是否可作為AMI早期的診斷標(biāo)準(zhǔn)做進(jìn)一步分析。

圖1 各組患者血漿miR-208b-3p的表達(dá)水平，以cel-miR-39-3p作為外參

圖2 miR-208b-3p表達(dá)水平與CK-MB相關(guān)性分析

圖3 ROC曲線評(píng)估血漿miR-208b-3p與hs-TnI和CK-MB診斷準(zhǔn)確性

圖4 ROC曲線評(píng)估STEMI亞組和NSTEMI亞組診斷準(zhǔn)確性

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The diagnostic value of circulating miR-208b-3p in acute myocardial infarction

ZHANG Yi-fan＊，WANG Li-jun，Dang Feng-qiang，et al.＊Department of Cardiology Ⅳ，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

XIE Lian-na，E-mail：xieln1963@163.com；LANG Ming-fei，E-mail：langmingfei@dlu.edu.cn

Objective This study explored the difference of circulating miR-208b-3p expressions between acute myocardial infarction（AMI） patients and healthy controls（HC）.The diagnostic value of the miR-208b expression in subgroups of AMI patients was also studied.Methods Plasma samples were taken from department of Cardiology，affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，140 AMI patients immediately after admission and 19 healthy controls，time from May 2012 to August 2014.The expression of miR-208b-3p was detected by qRT-PCR after reverse transcription by specific stem-loop primers and was compared with hs-TnI and CK-MB.The expression of miR-208b-3p was also examined in patients with ST segment elevation myocardial infarction（STEMI）and non-ST segment elevation myocardial infarction（NSTEMI）.The diagnostic value of the expression was assessed by ROC.Results The expression levels of plasma miR-208b-3p in AMI and HC groups were 43.86±7.50 and 2.05±0.62，respectively（P＜0.05）.The expression of miR-208b-3p was positively associated with CKMB levels（r=0.546，P＜0.01）.In ROC analysis，the AUC of miR-208b-3p，CK-MB and hs-TnI were 0.874（P＜0.01），0.976（P＜0.01）and 0.971（P＜0.01），respectively.The expression levels of miR-208b-3p in the STEMI and NSTEMI groups were 55.04±10.44 and 21.01±7.13，respectively（P＜0.05），and their AUC were 0.935 （P＜0.01）and 0.749（P＜0.01），respectively.Conclusion Circulating miR-208b-3p could be used as an early diagnostic marker in AMI patients.However，its diagnostic value was no better than that of hs-TnI or CK-MB.The diagnostic sensitivity and specificity of circulating miR-208b-3p were better for STEMI than for NSTEMI patients.

Acute myocardial infarction；Circulating miRNAs；MiR-208b；Diagnosis

116001 遼寧省大連市，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院循環(huán)四科（張一凡、王麗君、黨鳳強(qiáng)、齊麗梅、謝蓮娜）；大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院（徐越、郎明非）；大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院（孫晶）

謝蓮娜，E-mail：xieln1963@163.com；郎明非，E-mail：langmingfei@dlu.edu.cn

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.12.015

R542.2+2

A

1672-5301（2016）12-1108-04

2016-06-11）