鄭海旭,侯　虎,?；勰?陳鐵軍,李八方

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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白鰱魚皮明膠的脫脂方法及其脫脂前后理化特性的研究

鄭海旭,侯虎,?；勰?陳鐵軍,李八方*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

為了探究白鰱魚皮是水產(chǎn)明膠的良好來源,得到低脂肪含量的白鰱魚皮明膠,本實驗研究了白鰱魚皮的基本成分,白鰱魚皮明膠的脫脂方法,并對其脫脂前后的理化特性進行對比。通過國標等方法對白鰱魚皮進行基本成分分析,采用熱水提取法制備白鰱魚皮明膠并添加四種不同型號大孔樹脂(D101、X-5、XAD1180、AB-8)以靜態(tài)吸附的方式對明膠溶液進行脫脂處理。結果表明:白鰱魚皮富含蛋白質、礦物質元素等,可作為水產(chǎn)明膠的良好來源;經(jīng)D101型樹脂在40 ℃、樹脂添加量為10%的條件下處理的明膠溶液,脫脂效果最佳,脫脂率達到78.94%±2.98%;羥脯氨酸含量由6.77%±0.09%上升到7.17%±0.13%;脫脂前后明膠的紫外光譜均在221 nm處出現(xiàn)最大吸收峰;SDS-PAGE電泳圖譜均主要由β,α1,α2三條肽鏈組成;紅外光譜圖的趨勢基本相同,均具有膠原的典型官能團;脫脂后明膠的凝膠強度較脫脂前略有降低;脫脂后的明膠粘度較脫脂前有所增大;脫脂后的明膠中Ca、Mg、Zn含量較脫脂前分別增加了75.96%、284.13%和2.68%,但Cu、Fe、Mn含量較脫脂前分別降低了16.67%、48.11%和15.56%。

白鰱魚皮，明膠,大孔樹脂,脫脂,羥脯氨酸,理化性質

明膠是一種具有優(yōu)良生物學特性的變性膠原蛋白[1],主要涉及食品,制藥,化妝品,照相明膠等眾多工業(yè)領域[2]。近年來,明膠的全球需求量不斷增長,尤其是在亞洲。然而瘋牛病、口蹄疫等傳染病的發(fā)生以及宗教信仰等問題嚴重限制了這些陸地牲畜作為膠原原料的應用[3]。因此,尋找豬、牛皮和骨以外的明膠提取原料顯得尤為迫切。水產(chǎn)動物中,特別是魚皮,可能會成為哺乳動物明膠的良好替代產(chǎn)品。

白鰱魚(silver carp)是我國主要的淡水魚種,年產(chǎn)量約為352.48萬噸。在加工過程中產(chǎn)生的大量魚皮,魚鱗和魚骨等廢棄物,不僅導致環(huán)境污染,還導致資源浪費[4]。從富含膠原蛋白的廢棄魚皮中提取明膠就是一種對水產(chǎn)品廢棄物高值化利用的有效手段。

明膠中的脂肪含量是評定明膠品質的重要指標之一。脂肪含量過高會顯著影響明膠的色澤及透明度[5],油脂中的腥味成分也會影響明膠的風味,脂肪含量亦會影響明膠產(chǎn)品的粘度、凝膠強度等理化特性,降低產(chǎn)品品質。因此,對脂肪進行有效脫除成為明膠加工及應用領域亟待解決的問題。

以往的明膠脫脂一般是指對提取原料進行脫脂。常用的脫脂方法主要有皂化法、有機溶劑法、浸酸法等[6]。本實驗采用常應用于中藥制藥工藝中且安全、有效、操作簡單的物理吸附材料——大孔樹脂,直接對白鰱魚皮明膠溶液進行處理。通過在白鰱魚皮明膠溶液中添加不同質量分數(shù)的大孔樹脂,探究最佳脫脂效果及膠原的特征氨基酸——羥脯氨酸的含量損失情況,并對比脫脂前后的白鰱魚皮明膠的理化性質。為明膠溶液的脫脂提供新方法,且為得到高純度、高感官品質的低脂白鰱魚皮明膠提供實驗依據(jù)及理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白鰱魚購于青島市南山水產(chǎn)品市場,取魚皮,-20 ℃冷凍保存;D101,XAD1180,X-5型大孔樹脂購自北京索萊寶試劑有限公司;AB-8型大孔樹脂購自南開大學化工廠;甘油三酯試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

AL204型電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司;SHA-B型恒溫振蕩器國華電器有限公司;RE52CS型旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;Alpha1-4LD型冷凍干燥機德國Christ公司;UV-2401PC型紫外可見分光光度計日本島津公司;DYY-6C型電泳儀北京市六一儀器廠;Nicolet-200SXV傅立葉紅外光譜儀美國Nicolet公司;TMS-Pro物性分析儀美國FTC公司;MCR 101型流變儀安東帕科學儀器有限公司;VISTA-MPX電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀美國瓦里安有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1白鰱魚皮基本成分分析水分含量參照GB/5009.3-2010測定;蛋白質含量參照GB/5009.5-2010測定;脂肪含量采用Bligh-Dyer法測定[7];灰分含量參照GB/5009.4-2010測定;總糖含量參照GB/T9695.31-2008測定;羥脯氨酸含量測定采用氯胺T法[8];礦物質成分采用ICP-AES進行測定。

1.2.2白鰱魚皮明膠的提取[9]白鰱魚皮室溫下解凍,用濾紙吸干魚皮表面多余水分,并將魚皮剪成約1 cm×1 cm大小。采用熱水法提取白鰱魚皮明膠。將處理好的白鰱魚皮在0.01 mol/L檸檬酸溶液中浸泡約15 min使其溶脹,反復水洗魚皮至中性,按料液比1∶6(w∶v)加入蒸餾水,70 ℃水浴攪拌提取2 h,絹紗過濾后進行旋蒸濃縮,-50 ℃、0.1 MPa下冷凍干燥,即得到白鰱魚皮明膠,備用。

1.2.3大孔樹脂的選擇根據(jù)非極性樹脂及弱極性樹脂的表面疏水性較強,適用于極性溶劑中吸附非極性物質的特點,本實驗選取了三種非極性樹脂(D101、X-5、XAD1180)及一種弱極性樹脂(AB-8),對明膠溶液中的非極性脂質進行吸附。

1.2.4大孔樹脂預處理[10]將大孔樹脂以0.5 BV 95%乙醇浸泡24 h,蒸餾水反復洗凈至無醇味。以2 BV 4% HCl浸泡2～4 h,水洗至中性。以2 BV 4% NaOH浸泡2～4 h,水洗至中性,濕基保存,備用。

1.2.5大孔樹脂靜態(tài)吸附實驗在濃度為20 mg/mL的白鰱魚皮明膠溶液中加入不同型號(D101、X-5、XAD1180、AB-8)及添加量(2%、5%、10%、15%、20%)的大孔樹脂,40 ℃水浴下攪拌1.5 h,6000 r/min離心15 min,取上清液,-50 ℃、0.1 MPa下冷凍干燥得到低脂白鰱魚皮明膠。

1.2.6白鰱魚皮明膠脂肪含量的測定以白鰱魚皮明膠中甘油三酯含量計脂肪含量,采用甘油三酯試劑盒進行測定。

脫脂率(%)=[(脫脂前的脂肪含量-脫脂后的脂肪含量)/脫脂前的脂肪含量]×100

1.2.7白鰱魚皮明膠理化性質的測定

1.2.7.1白鰱魚皮明膠的羥脯氨酸含量測定采用氯胺T法對白鰱魚皮明膠中的羥脯氨酸含量進行測定[8]。

1.2.7.2紫外吸收光譜掃描配制濃度為0.5 mg/mL的白鰱魚皮明膠溶液,用紫外分光光度計在200～400 nm近紫外光區(qū)以100 nm/min進行掃描,掃描精度為0.5 nm。

1.2.7.3聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳參考Laemmli[11]的方法分析明膠樣品,采用7.5%的分離膠和5%的濃縮膠,樣品濃度為2 mg/mL與SDS上樣緩沖液1∶4混合,上樣量為20 μL;采用直流恒壓電源,電壓為 100 V,電泳2～3 h。染色液染色20 min后脫色處理。用凝膠成像系統(tǒng)對脫色后的明膠進行紫外透射拍照。

1.2.7.4傅立葉紅外光譜分析將凍干的明膠與干燥后的KBr置于瑪瑙研缽中磨成均勻粉末狀,適量裝樣,手動壓片,采用傅立葉紅外光譜儀對樣品在 4000～500 cm-1掃描,分辨率為 2 cm-1。

1.2.7.5凝膠強度的測定配制6.67%的明膠水溶液,4 ℃條件下陳化16～18 h,確保明膠在溫度8～9 ℃下被測定。設定程序條件參數(shù):r=6.35 mm的圓柱狀平頭沖頭,下壓高度為4 mm,速度為1 mm/s。

表1　白鰱魚皮基本成分

1.2.7.6粘度的測定將10 mg明膠樣品溶于10 mL蒸餾水中,采用流變儀在15～45 ℃之間檢測樣品粘度。

1.2.7.7礦物質成分測定將0.5 g明膠樣品加入到消化瓶中,并加入6 mL硝酸,將消化瓶置于電爐上進行濕法消化,直至消化液透明。冷卻后,定溶至50 mL,備用。采用ICP-AES進行測定。

1.2.8數(shù)據(jù)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行處理,數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。

2　結果與分析

2.1白鰱魚皮基本成分

由表1可知白鰱魚皮的水分含量為61.4%±1.55%。在白鰱魚皮干物質中主要成分為蛋白質,約占71.80%±0.41%,羥脯氨酸含量可達6.82%±0.95%,這說明白鰱魚皮是一種較好的膠原蛋白的水產(chǎn)品加工原料。然而其高脂肪含量卻對高品質白鰱魚皮明膠的提取造成了不良影響。

2.2白鰱魚皮礦物質組成(ICP-AES)

由表2可知,被檢測的八種礦物質中白鰱魚皮含有六種,其中Ca、Zn、Mg、Fe含量較高,這可能與白鰱魚生長的淡水環(huán)境有關,說明白鰱魚皮具有較高的應用價值。Cd和Pb兩種元素未檢測到,顯示了白鰱魚皮的安全性。并且白鰱魚皮富含礦物質這一事實也為提取富含礦物質的白鰱魚皮明膠提供可靠依據(jù)。

表2　白鰱魚皮礦物質含量(μg/g)

2.3大孔樹脂對白鰱魚皮明膠脫脂效果的影響

由圖1(A，B，C)可知,D101、X-5、XAD1180型大孔樹脂添加量在2%～10%之間,脫脂率均呈上升趨勢,且添加量為10%時可達到最大脫脂率,分別為78.94%±2.98%、69.46%±4.47%、64.19%±2.98%,當樹脂添加量在10%～20%之間時,脫脂率均呈下降趨勢。由圖1D可知,AB-8型大孔樹脂的添加量在2%～15%之間,脫脂率呈上升趨勢,添加量為15%時,脫脂率達到最高68.40%±8.94%。這說明了一定添加量的大孔樹脂可對白鰱魚皮明膠溶液起到良好的脫脂效果。

羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸,其含量可反映膠原蛋白的含量變化,從而間接反映了明膠的純度。經(jīng)實驗測得,脫脂前的明膠羥脯氨酸含量為6.77%±0.09%。由圖1A可知,D101型大孔樹脂添加量為10%時,明膠中羥脯氨酸含量最高,為7.17%±0.13%,而添加量為5%和15%時,明膠中的羥脯氨酸均有損失,低于脫脂前。由圖1B可知,羥脯氨酸含量隨著X-5型大孔樹脂添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當添加量為10%時,羥脯氨酸含量達到最高,為7.65%±0.01%。由圖1C可知,羥脯氨酸含量隨著XAD1180型大孔樹脂添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,且添加量為2%、5%和10%時,羥脯氨酸含量均高于脫脂前,添加量為15%和20%時,羥脯氨酸含量低于脫脂前。由圖1D可知,羥脯氨酸含量隨著AB-8型大孔樹脂添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當添加量為15%時,羥脯氨酸含量達到最高,為6.99%±0.14%。由此可知,一定添加量的大孔樹脂可對明膠溶液起到濃縮的作用,提高了明膠的純度,并且使得明膠溶液顏色更加澄清透明。因此,本實驗選取脫脂率最高的明膠(經(jīng)添加量為10%的D101型大孔樹脂脫脂處理后的明膠)作為后續(xù)理化性質研究的對象。

2.4白鰱魚皮明膠脫脂前后的理化性質研究

2.4.1紫外吸收光譜分析結果脫脂前后對白鰱魚皮明膠溶液的紫外吸收光譜的影響如圖2所示。大多數(shù)蛋白質在280 nm處會出現(xiàn)紫外強吸收峰,這是由于色氨酸的存在導致的。然而不同于大多數(shù)蛋白,明膠中幾乎不含有色氨酸,因此不會在280 nm處出現(xiàn)紫外強吸收峰。脫脂前后的白鰱魚皮明膠均在221 nm處顯示了最強紫外吸收峰,說明明膠肽鏈分子中存在酰胺鍵[12]。這與資料報道的膠原蛋白吸收峰位置(225 nm)一致[13],說明脫脂處理并未對白鰱魚皮明膠的紫外吸收光譜有影響。

圖2　白鰱魚皮明膠脫脂前后的紫外吸收光譜Fig.2　Ultraviolet absorption spectroscopy of gelatin from silver carp skin

2.4.2聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳結果由圖3可知,脫脂前后的白鰱魚皮明膠的電泳圖譜沒有顯示明顯差異,這說明D101型大孔樹脂處理并沒有影響明膠的結構。兩種明膠均主要包含β、α1、α2三條肽鏈和少量的γ鏈,分子量大約在105～250 ku之間,具備典型的Ⅰ型膠原蛋白特征。白鰱魚皮明膠至少含有兩條α鏈(α1和α2),這是因為α1與α3在SDS-PAGE膠上無法辨別[14]。此外,還可以看出,熱水法所提取的白鰱魚皮明膠中出現(xiàn)了低分子條帶,這可能是因為在提取過程中,熱水的作用使部分膠原降解成了小分子組分。

圖3　白鰱魚皮明膠脫脂前后的SDS-PAGE電泳圖Fig.3　SDS-PAGE electrophoresis pattern of gelatin from silver carp skin注:1.蛋白標準品;2.脫脂前白鰱魚皮明膠;3.脫脂后白鰱魚皮明膠。

圖4　白鰱魚皮明膠脫脂前后的紅外光譜圖Fig.4　Infrared spectra of gelatin from silver carp skin

2.4.3紅外光譜分析結果由圖4可以看出,脫脂前后的白鰱魚皮明膠的紅外光譜趨勢基本相同。一般而言,在紅外光譜中N-H基團伸縮振動產(chǎn)生的酰胺A的吸收通常在3400～3440 cm-1處,當含有N-H基團的分子肽段參與氫鍵的形成時,N-H的伸縮振動會向低頻率移動,通常在3300 cm-1左右[15]。由圖4可以看到,脫脂前后的白鰱魚皮明膠中酰胺A的吸收峰出現(xiàn)在3228.37 cm-1左右,表明了蛋白分子中存在氫鍵。氨基酸之間含有大量肽鍵,而羰基鍵的伸縮振動導致酰胺Ⅰ帶的特征吸收波數(shù)通常在1625～1690 cm-1[16],酰胺鍵為蛋白質二級結構變化的敏感的官能團,常被用于蛋白質的二級結構分析。脫脂前后的白鰱魚皮明膠的酰胺Ⅰ帶的吸收峰在1654.55 cm-1左右,結果符合酰胺Ⅰ帶的出峰位置。兩種明膠的紅外圖譜顯示在1237.32 cm-1左右處均出現(xiàn)吸收峰,表明脫脂前后的明膠均有酰胺Ⅲ帶存在[17]。

2.4.4凝膠強度測定結果凝膠強度是衡量明膠品質的重要指標之一,影響凝膠強度的因素有很多,比如原料、提取工藝條件、明膠中羥脯氨酸含量等有關。一般來說,明膠的羥脯氨酸含量越高,凝膠強度也就越高。本實驗中脫脂前的明膠羥脯氨酸含量為6.77%±0.09%,脫脂后為7.17%±0.13%,但由圖5可以看出,脫脂后白鰱魚皮明膠凝膠強度(35.02±4.41)N/mm2反而比其脫脂前(40.28±1.18)N/mm2要低,這可能是因為脫脂前的白鰱魚皮明膠中含有疏水性的脂類所引起。

2.4.5粘度測定結果由圖6可知,兩種明膠的粘度均隨著溫度的升高而平穩(wěn)的降低,且脫脂后的白鰱魚皮明膠的粘度大于脫脂前。蛋白質中的氨基酸組成、分子量及蛋白分子的多分散性等諸多因素均影響著明膠溶液的粘度,當明膠中的羥脯氨酸含量較多時,其粘度較大[18]。而脫脂后的明膠中羥脯氨酸含量較脫脂前有所升高,這使明膠的濃度得到增加,此時明膠溶液分子內和分子間的氫鍵作用增強,從而粘度增大。因此,經(jīng)D101型大孔樹脂脫脂后的明膠純度提高。

表3　白鰱魚皮明膠礦物質含量(μg/g)

圖5　白鰱魚皮明膠脫脂前后的凝膠強度Fig.5　Gel strength of gelatin from silver carp skin注:1.脫脂前白鰱魚皮明膠;2.脫脂后白鰱魚皮明膠。

圖6　白鰱魚皮明膠脫脂前后的粘度Fig.6　Viscosity of gelatin from silver carp skin

2.4.6礦物質含量由表3可知,白鰱魚皮明膠富含多種礦物質元素。被檢測的8種元素中,Ca、Zn、Mg、Fe含量較高,其中脫脂后白鰱魚皮明膠的Ca和Mg含量明顯高于脫脂前,分別增加了75.96%和284.13%,脫脂后Zn含量略高于脫脂前,增加了2.68%。脫脂后Cu、Fe、Mn含量較脫脂前有所降低,分別降低了16.67%、48.11%和15.56%。Cd和Pb兩種元素未檢測到。綜上所述,脫脂前后的白鰱魚皮明膠均含有豐富的礦物元素,但含量各有差異。

3　結論

白鰱魚皮營養(yǎng)成分豐富,是水產(chǎn)膠原蛋白的良好來源。D101型大孔樹脂添加量為10%時對白鰱魚皮明膠溶膠的脫脂效果最好,脫脂率達到78.94%±2.98%,羥脯氨酸含量由6.77%±0.09%上升到7.17±0.13%。對比其與脫脂前的白鰱魚皮明膠理化性質,結果表明:低脂明膠的紫外光譜、SDS-PAGE電泳圖譜及紅外光譜均沒有明顯變化;脫脂前明膠的凝膠強度略高于脫脂后;低脂明膠的粘度大于脫脂前;脫脂后的明膠中Ca、Mg、Zn含量較脫脂前分別增加了75.96%、284.13%和2.68%,Cu、Fe、Mn含量較脫脂前分別降低了16.67%、48.11%和15.56%。以上結果說明脫脂并未影響明膠的結構,且提高了明膠品質。

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Research on degreasing methods and physical-chemical characteristics with degreasing before and after of gelatin from silver carp skin

ZHENG Hai-xu,HOU Hu,NIU Hui-na,CHEN Tie-jun,LI Ba-fang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to explore whether silver carp skin was a kind of good sources of gelatin or not,and to obtain gelatin from silver carp skin with low-fat,the degreasing methods for gelatin were investigated,and the physical and chemical characteristics of the gelatin with degreasing before and after were compared. The basic ingredients of silver carp skin were comprehensive analyzed. The gelatin of silver carp skin was extracted by hot water. Then made degreasing treatments with four kinds of macroporous resins(D101,X-5,XAD1180,AB-8)by the way of static adsorption. The results were obtained as follows:silver carp skin were rich in protein and minerals and could be used as a kind of good sources of aquatic gelatin;The rate of degreasing can be reached at 78.94%±2.98%,the hydroxyproline content rose from 6.77%±0.09% to 7.17%±0.13% after treated with D101 in the gelatin solution when temperature was 40 ℃,resin amount was 10%. UV and FT-IR measurements of gelatin without degrease and gelatin with degrease were quite similar,and all of them showed maximum absorption peak at 221 nm. SDS-PAGE pattern indicated that both of them containedβ,α1andα2chains. Gel strength of gelatin without degreasing was light higher than that of gelatin with degreasing. However,the viscosity of gelatin with degreasing was higher than that of gelatin without degreasing. Compared with the gelatin without degreasing,the contents of Ca,Mg and Zn in gelatin with degreasing were increased by 75.96%,284.13% and 2.68%,respectively,while the contents of Cu,Fe and Mn in gelatin with degreasing were decreased by 16.67%,48.11% and 15.56%,respectively.

silver carp skin;gelatin;macroporous resins;degrease;hydroxyproline;physical-chemical characteristics

2015-11-27

鄭海旭(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與功能食品及水產(chǎn)品高值化利用，E-mail:hlehx2008@163.com。

李八方(1953-),男，教授，研究方向:海洋生物活性物質及功能性食品，E-mail:bfli@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目(31471606,31401476)；山東省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目；海洋公益性行業(yè)科研專項(201105029)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)12-0278-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.044