董學艷,姜鐵民,劉繼超,陳歷俊

(國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京市乳品工程技術研究中心,北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

?

高通量快速檢測母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量方法的比較研究

董學艷,姜鐵民,劉繼超,陳歷俊*

(國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京市乳品工程技術研究中心,北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

分別利用Lowry、BCA和Bradford三種方法對母乳中總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的含量進行了測定,并以凱氏定氮法為標準,對三種方法的檢測結果進行了比較。結果表明Lowry和Bradford法適用于母乳中總蛋白含量的測定,Lowry法適于母乳中乳清蛋白含量的測定,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適用于母乳中酪蛋白含量的測定。采用上述方法,只需要4 mL母乳樣本,1.5 h內即可完成母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的微量、高通量快速測定。上述方法適用于較大量母嬰營養(yǎng)狀況的調查研究,可為母乳化嬰幼兒配方乳粉的研制以及促進嬰幼兒生長發(fā)育提供科學依據(jù)。

母乳,總蛋白,乳清蛋白,酪蛋白,快速測定

母乳是嬰兒生命初始階段最理想的食物,它含有優(yōu)質蛋白質、豐富的脂肪酸、乳糖和免疫活性物質等,且易于消化吸收,對嬰兒生長發(fā)育起著至關重要的作用。母乳的營養(yǎng)成分組成及營養(yǎng)模式一直是嬰幼兒配方乳粉的黃金標準,對母乳的相關研究也成為國內外嬰幼兒配方乳粉開發(fā)的基礎。蛋白質是母乳中最重要的營養(yǎng)物質之一,與嬰幼兒的營養(yǎng)狀況息息相關。其乳清蛋白和酪蛋白的比例是母乳化嬰幼兒配方乳粉的參考依據(jù),也是決定嬰幼兒配方乳粉質量的重要指標。為了改善嬰幼兒營養(yǎng)和嬰幼兒配方乳粉質量,母乳中總蛋白質、乳清蛋白和酪蛋白含量的檢測是非常重要的。

常用的母乳中總蛋白質、乳清蛋白和酪蛋白含量檢測方法為凱氏定氮法[1-2],雖然是經(jīng)典的蛋白質檢測方法,但由于樣品用量大,操作復雜,測量時間較長,使其不利于較大量母乳樣本的分析。母乳分析儀是近年來發(fā)展較為迅速的用于母乳中蛋白質等宏量成分的快速檢測方法[3],該方法能測定母乳總蛋白含量,但無法測出乳清蛋白和酪蛋白的含量,且儀器成本較高。在蛋白質的眾多檢測方法中比色法下屬分支最多,使用最為靈活。使用較多的有Lowry法(Folin-酚試劑法),BCA法(二喹啉甲酸,Bicinchoninic acid)和考馬斯亮藍法(Bradford法)[4-5]。這類方法的共同特點是樣品用量少、操作簡單、測定時間短,且可以實現(xiàn)高通量等目的,已分別在牛乳蛋白質檢測中得到不同程度的應用[6]。

表2　三種方法檢測母乳總蛋白含量的比較Table 2　The comparison of the total protein content detected by three methods

注:同行中標不同字母的均值有顯著性差異(p<0.05)，表2、表3同。

本研究針對母乳中總蛋白質、乳清蛋白和酪蛋白含量測定過程中存在的樣品用量大、操作復雜、耗時較長及檢測儀器成本較高等問題,以凱氏定氮法為標準,對比研究了Lowry,BCA和Bradford三種檢測方法對母乳蛋白質的檢測,以期找到適用于母乳中總蛋白質、乳清蛋白和酪蛋白含量的微量、高通量快速測定方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

母乳樣本來源于北京地區(qū),采集上午9～10點哺乳前乳樣(1,2分別是同一人分娩后第10、30 d的母乳;3,4,5分別是同一人分娩后第6、30、60 d的母乳),存入-80 ℃冰柜待用;Lowry法蛋白濃度測定試劑盒北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒北京索萊寶科技有限公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術。

3K-15高速冷凍離心機美國Sigma公司;BioTek Elx 800酶標儀美國伯騰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1母乳樣本的處理取4 mL母乳,0.5 mL用于總蛋白的測定,剩余3.5 mL 4 ℃條件下11000 r/min離心20 min。去掉上層脂肪,取中間清液,用鹽酸調節(jié)pH至4.6,室溫靜置0.5 h,4 ℃ 11000 r/min離心20 min,上清液為乳清蛋白,酪蛋白沉淀用變性劑(含8 mol/L尿素,165 mmol/L Tris,44 mmol/L檸檬酸鈉和0.3%β-巰基乙醇)溶解。

1.2.24種方法測定母乳中的蛋白質含量凱氏定氮法:凱氏定氮法按照GB/T 5009.5-2010測定母乳中總蛋白質含量。Lowry法,BCA法和Bradford法分別按照試劑盒的操作說明繪制標準曲線并進行樣本的檢測。

2　結果與分析

2.1三種方法的標準曲線

Lowry,BCA和Bradford三種方法分別以牛血清白蛋白為標準蛋白制作標準曲線,根據(jù)繪制標準曲線得到的方程如表1所示。由表1中數(shù)據(jù)可知,在合適的濃度范圍內,牛血清白蛋白與Lowry,BCA和Bradford反應體系線性關系較好,牛血清白蛋白適合作為標準蛋白。

表1　三種方法的標準曲線方程Table 1　The standard curve equations of three methods

2.2三種方法檢測母乳總蛋白結果

我國國家標準中測定食品中蛋白質(GB/T 5009.5-2010)[7]有三種方法:凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法。凱氏定氮法為最重要和經(jīng)典的方法,也被用于母乳中總蛋白含量的測定。Shi等[8]用凱氏定氮法測定母乳中總蛋白的含量為12.7～13.8 mg/mL。此外,Casadio等[9]和Silvestre等[10]分別利用Bradford法檢測了母乳中總蛋白的含量,分別為12.0 mg/mL和11.9 mg/mL。

以凱氏定氮檢測法作為標準,利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測母乳總蛋白含量的結果如表2所示。由表2可知,凱氏定氮法、Lowry法、BCA法、Bradford法檢測5份母乳中總蛋白含量分別為13.1～14.8、11.94～13.95、17.94～19.78、13.19～14.44 mg/mL。Lowry和Bradford法對母乳中總蛋白含量的檢測結果與凱氏定氮法的檢測結果比較無顯著性差異(p>0.05),且Lowry和Bradford法的檢測結果比較也沒有顯著性差異(p>0.05)。BCA法的檢測結果顯著高于凱氏定氮法,Lowry和Bradford法的檢測結果(p<0.05)。結果表明Lowry和Bradford法適用于母乳中總蛋白含量的測定。

BCA法的檢測結果高于凱氏定氮、Lowry和Bradford法,可能是因為測定過程中受到脂肪的影響。由于BCA法的檢測原理是在堿性條件下,蛋白質將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物,測定其在562 nm處的吸收值。脂類物質在500～600 nm處也有強烈的吸收,因此會干擾BCA法對蛋白濃度的測定[11]。

2.3三種方法檢測母乳乳清蛋白結果

利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測母乳乳清蛋白含量的結果如表3所示。由表3可知,Lowry法、BCA法、Bradford法檢測5份母乳中乳清蛋白的含量分別為7.86～8.47、10.16～13.88、4.50～6.36 mg/mL,且三種方法檢測的結果之間均存在顯著性差異(p<0.05)。

Kunz等[2]用凱氏定氮法測定了母乳中乳清蛋白的含量,從過渡乳到成熟乳乳清蛋白的含量為7.3～8.6 mg/mL,與Lowry法的檢測結果基本一致。Yuen等[12]用Bradford法測定母乳成熟乳中乳清蛋白的含量為4.04 mg/mL,與本實驗中Bradford法的測定結果基本一致,但是低于Lowry法。Yuen等與Kunz等測定的母乳乳清蛋白的含量不同可能是因為受不同地區(qū)乳母膳食不同影響。凱氏定氮法作為蛋白含量測定的標準方法,比較三種方法與凱氏定氮法的檢測結果可知,Lowry法更適于母乳中乳清蛋白含量的測定。

表3　三種方法檢測母乳乳清蛋白含量的比較Table 3　The comparison of the whey protein content detected by three methods

2.4三種方法檢測母乳酪蛋白結果

利用Lowry,BCA和Bradford三種方法檢測母乳酪蛋白含量的結果如表4所示。由表4可知,Lowry法、BCA法、Bradford法檢測5份母乳中酪蛋白的含量為5.22～5.78、5.38～6.13、5.15～5.64 mg/mL,且三種方法檢測的結果之間均沒有顯著性差異(p>0.05)。

Kunz等[2]用凱氏定氮法測定了母乳中酪蛋白的含量,從過渡乳到成熟乳酪蛋白的含量為5.5～5.9 mg/mL。Yuen等[12]用Bradford法測定母乳成熟乳中酪蛋白的含量為6.02 mg/mL。二人測得的結果均與本實驗中Lowry、BCA和Bradford三種方法的檢測結果基本一致。由此可知,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適用于母乳中酪蛋白含量的測定。

表4　三種方法檢測母乳酪蛋白含量的比較Table 4　The comparison of the casein protein content detected by three methods

3　結論

以凱氏定氮法為標準,對比研究了Lowry,BCA和Bradford三種方法對母乳蛋白質含量的測定,確定了母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量的微量、高通量快速測定方法。Lowry和Bradford法適于母乳中總蛋白含量的測定,Lowry法適于母乳中乳清蛋白含量的測定,Lowry、BCA和Bradford三種方法均適于母乳中酪蛋白含量的測定。分別采用Lowry和Bradford法;Lowry法;Lowry、BCA和Bradford方法,使用4 mL母乳樣本,同批次檢測45個試樣,1.5 h內(凱氏定氮法同批次檢測20個試樣,耗時6 h)可實現(xiàn)母乳總蛋白、乳清蛋白和酪蛋白含量的高通量快速測定,方法簡便、準確。

[1]Rudloff S,Kunz C. Protein and nonprotein nitrogen components in human milk,bovine milk,and infant formula:quantitative and qualitative aspects in infant nutrition[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition,1997,24(3):328-344.

[2]Kunz C,L?nnerdal B. Re-evaluation of the whey protein/casein ratio of human milk[J]. Acta Paediatr,1992,81(2):107-112.

[3]Fusch G,Rochow N,Choi A,et al. Rapid measurement of macronutrients in breast milk:How reliable are infrared milk analyzers?[J]. Clinical Nutrition,2015,34:465-476.

[4]Campion E M,Loughran S T,Walls D. Protein quantitation and analysis of purity[M]. Protein Chromatography Humana Press,2011:229-258.

[5]Chutipongtanate S,Watcharatanyatip K,Homvises T,et al. Systematic comparisons of various spectrophotometric and colorimetric methods to measure concentrations of protein,peptide and amino acid:Detectable limits,linear dynamic ranges,interferences,practicality and unit costs[J]. Talanta,2012,98:123-129.

[6]劉立新. 牛乳蛋白質檢測技術的研究[D]. 西安:陜西科技大學,2011.

[7]食品中蛋白質的測定[S]. GB/T 5009. 5-2010.

[8]Shi Yd,Sun Gq,Zhang Zg,et al. The chemical composition of human milk from Inner Mongolia of China[J]. Food Chem,2011,127(3):1193-1198.

[9]Casadio Y S. Evaluation of a Mid-Infrared analyzer for the determination of the macronutrient composition of human milk[J]. Journal of Human Lactation,2010,26(4):376-383.

[10]Silvestre D,Fraga M,Gormaz M,et al. Comparison of mid-infrared transmission spectroscopy with biochemical methods for the determination of macronutrients in human milk[J]. Maternal & Child Nutrition,2012,10(3):373-382.

[11]高曉非,文曉靜. 乙醇沉淀-二喹啉甲酸法測定含脂類樣品中蛋白質的含量[J]. 醫(yī)藥導報,2010,29(12):1630-1633.

[12]Yuen J W M,Loke A Y,Gohel M I. Nutritional and immunological characteristics of fresh and refrigerated stored human milk in Hong Kong:a pilot study[J]. Clin Chim Acta,2012,413:1549-1554.

A comparative study of rapid and high-throughput detection method for total protein,whey protein and casein in human milk

DONG Xue-yan,JIANG Tie-min,LIU Ji-chao,CHEN Li-jun*

(National Health Engineering Research Center for Maternal and Infant Dairy,The Dairy Engineering and Technology Research Center of Beijing,Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd,Beijing 100163,China)

The contents of human milk total protein,whey protein and casein were determined using Lowry,BCA and Bradford,respectively,and the results were compared with the Kjeldahl. The results showed that both Lowry and Bradford methods were suitable for determination of total protein content,while the whey protein content determined using Lowry method was closer to Kjeldahl. Lowry,BCA and Bradford methods were applicable for determination of the content of casein. Adopt the above-mentioned methods,the contents of human milk total protein,whey protein and casein can be rapidly determined within 1.5 h using only 4 mL human milk. These methods were suitable for the investigation of a large number of maternal and child nutritional status so that it provided the scientific basis for the development of human milk simulated infant formula and infant growth promotion.

human milk;total protein;whey protein;casein;fast determination

2015-07-13

董學艷(1983-)，女，博士，研究方向：乳品科學，E-mail:18910005185@163.com。

陳歷俊(1967-)，男，教授級高級工程師，研究方向：新型乳制品和質量安全控制技術研究與開發(fā)，E-mail:chenlijun@sanyuan.com.cn。

北京市重大科技計劃項目(D141100004814002)

TS252.1

A

1002-0306(2016)05-0308-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.053