陳忠軍,劉　靜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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乳桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)與酵母菌DNA相互作用研究

陳忠軍,劉靜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

本研究以具有抑酵母活性的乳桿菌ALAC-3和ALAC-4為研究對(duì)象,以白假絲酵母為指示菌,通過紫外光譜和熒光光譜法研究了乳桿菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)與酵母菌DNA的相互作用機(jī)制。結(jié)果表明:酵母菌DNA與乳桿菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)反應(yīng)后,其紫外吸收值減小,產(chǎn)生了減色效應(yīng);隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),紫外吸收值增加,呈現(xiàn)增色效應(yīng)。加入抑菌物質(zhì)后,酵母菌DNA熒光強(qiáng)度降低。抑菌物質(zhì)與EB-DNA復(fù)合體系反應(yīng)后熒光強(qiáng)度降低,EB與抑菌物質(zhì)-DNA復(fù)合體系反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增加,說明溶液體系存在抑菌物質(zhì)-DNA與EB-DNA兩個(gè)復(fù)合體系競(jìng)爭(zhēng)。

乳桿菌,抑酵母菌物質(zhì),DNA,紫外光譜法,熒光光譜法

酵母菌在很早以前就被廣泛應(yīng)用于釀酒、食品、醫(yī)藥工業(yè)等。然而某些酵母菌可引起人和植物的病害[1],還有一些能夠引起食品的腐敗變質(zhì)。乳桿菌不僅能抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng),也能產(chǎn)生抗真菌化合物,對(duì)真菌起到抑制作用[2-4]。目前對(duì)具抑細(xì)菌活性乳桿菌的研究工作已經(jīng)有很大進(jìn)展[5],但對(duì)于具抑真菌能力乳桿菌的研究還比較新,且主要集中在抑菌物質(zhì)與真菌細(xì)胞膜作用方面。到目前為止,乳桿菌是否與真菌的染色體DNA發(fā)生作用尚不清楚[6]。因此,對(duì)具有抑酵母菌作用的乳桿菌進(jìn)行深入研究,揭示其抑菌作用機(jī)理具有重大的理論意義,為天然食品防腐劑的開發(fā)及其利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳桿菌從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出的2株乳桿菌ALAC-3、ALAC-4;指示菌白假絲酵母(Candidaalbicans)標(biāo)準(zhǔn)菌株,編號(hào)為32819,來自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養(yǎng)基蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、Tween 80 mL/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、葡萄糖20 g/L,調(diào)節(jié)pH至6.5,121 ℃、20 min滅菌[7-8];YEPD培養(yǎng)基酵母提取粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L,調(diào)節(jié)pH至6.0,115 ℃、20 min滅菌[6-8];0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)稱取固體Tris 1.211 g于燒杯中,加入80 mL超純水,充分?jǐn)嚢枞芙?。用濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,然后定容至100 mL,高溫高壓滅菌后,室溫保存?zhèn)溆?溴化乙錠(10 mg/mL)。

SW-CJ-2FD型垂直凈化工作臺(tái)蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司;LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;DPX-9002B-1/2型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;IKA?RV 10 digital型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;島津RF5301熒光分光光度計(jì)杭州英斯特科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳桿菌抑菌物質(zhì)的制備活化三代的乳桿菌擴(kuò)培至MRS液體培養(yǎng)基中(37 ℃,24 h),將所得發(fā)酵液離心(4000 r/min,10 min),取上清液。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上清液進(jìn)行濃縮至25倍,得到濃縮液留下備用。在濃縮液中加入適量的飽和硫酸銨溶液,放入4 ℃冰箱中放置過夜,取出后冷凍離心(4 ℃,8000 r/min,20 min),棄去上清液可得蛋白質(zhì)沉淀粗提物。粗提物經(jīng)初步純化后[15],得到蛋白質(zhì)化合物作為抑菌物質(zhì),用滅菌蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度的抑菌物質(zhì)溶液,質(zhì)量濃度分別為3×10-3、6×10-3、9×10-3g/mL,放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2酵母菌DNA的提取采用玻璃珠法[9]提取酵母菌DNA。

1.2.3紫外光譜法檢測(cè)抑菌物質(zhì)與DNA的相互作用在0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)介質(zhì)中,將40 μL濃度為398.0 ng/μL的DNA與不同濃度的抑菌物質(zhì)水溶液于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)3、6、12、24 h后,分別測(cè)其λ為220～320 nm范圍的紫外吸收光譜。

1.2.4抑菌物質(zhì)與DNA結(jié)合的熒光光譜分別取各濃度的抑菌物質(zhì)40 μL,與40 μL DNA溶液置于EP管中混合均勻,在0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)介質(zhì)中測(cè)定熒光激發(fā)波長(zhǎng)λex=310 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)λem為330～600 nm范圍的熒光光譜。

1.2.5抑菌物質(zhì)對(duì)復(fù)合體系EB-DNA相互作用的熒光光譜EB溶液的配制:將濃度為10 mg/mL的EB 10 μL用超純水稀釋至2.5 mL,其最終濃度為79.8 μmol/L,置于棕色瓶中,4 ℃避光保存?zhèn)溆?。分別取40 μL EB溶液和40 μL DNA溶液,置于EP管中混合均勻,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光放置30 min,然后分別加入各濃度的抑菌物質(zhì)40 μL,混合均勻,在30 ℃避光放置30 min。測(cè)定各反應(yīng)體系熒光激發(fā)波長(zhǎng)λex=310 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)λem為330～550 nm范圍的熒光光譜。

1.2.6EB對(duì)復(fù)合體系抑菌物質(zhì)-DNA相互作用的熒光光譜分別取40 μL濃度為3×10-3g/mL的抑菌物質(zhì)溶液和40 μL DNA溶液4份,置于EP管中混合均勻,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光放置30 min,然后分別加入不同濃度的EB再次混勻,使得各反應(yīng)體系中的EB濃度分別為0、19.95、39.90、79.80 μmol/L。測(cè)定各反應(yīng)體系熒光激發(fā)波長(zhǎng)λex=310 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)λem為330～550 nm范圍的熒光光譜。

2　結(jié)果與討論

2.1紫外光譜法檢測(cè)抑菌物質(zhì)與DNA的相互作用

2.1.1不同濃度抑菌物質(zhì)與DNA相互作用的紫外光譜將提取得到的白假絲酵母DNA與不同濃度的抑菌物質(zhì)于30 ℃避光反應(yīng)后,測(cè)定其紫外吸收光譜,結(jié)果見圖1、圖2。

圖1　ALAC-3產(chǎn)抑菌物質(zhì)與DNA相互作用的紫外光譜Fig.1　UV absorption spectra of the interaction between DNA and different concentrations of antiyeast substance produced by ALAC-3

圖2　ALAC-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)與DNA相互作用的紫外光譜Fig.2　UV absorption spectra of the interaction between DNA and different concentrations of antiyeast substance produced by ALAC-4

從圖1和圖2可以看出,抑菌物質(zhì)的加入使酵母DNA紫外吸收光譜發(fā)生了一定變化。最大吸收峰有紅移的趨勢(shì),未加入抑菌物質(zhì)時(shí),ALAC-3的最大吸收峰在259 nm處,當(dāng)抑菌物質(zhì)濃度為0.009 g/mL時(shí),其最大吸收峰由259 nm移到了261 nm。ALAC-4在未加抑菌物質(zhì)時(shí),最大吸收峰在258 nm處,當(dāng)抑菌物質(zhì)濃度為0.009 g/mL時(shí),其最大吸收峰由258 nm移到了260 nm。且隨著抑菌物質(zhì)濃度的增加,紫外吸收值明顯降低,產(chǎn)生了減色效應(yīng)。而且ALAC-4紫外吸收值降低的程度高于ALAC-3,說明ALAC-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)酵母菌DNA的影響大于ALAC-3。

這可能是由于抑菌物質(zhì)與DNA表面的磷酸基團(tuán)作用,導(dǎo)致DNA主鏈電荷密度降低,DNA雙鏈繞性增大,結(jié)構(gòu)趨于攏縮,從而構(gòu)象發(fā)生變化,它的一部分發(fā)色團(tuán)內(nèi)陷,因此呈現(xiàn)減色效應(yīng)[6]。

2.1.2抑菌物質(zhì)與DNA相互作用不同時(shí)間的紫外光譜將白假絲酵母DNA與濃度為3×10﹣3g/mL的抑菌物質(zhì)于30 ℃避光反應(yīng)后,測(cè)定其紫外吸收光譜,結(jié)果見圖3、圖4。

圖3　ALAC-3產(chǎn)抑菌物質(zhì) 與DNA相互作用不同時(shí)間的紫外光譜Fig.3　UV absorption spectra of the interaction between DNA and antiyeast substance produced by ALAC-3 at different time

圖4　ALAC-4產(chǎn)抑菌物質(zhì) 與DNA相互作用不同時(shí)間的紫外光譜Fig.4　UV absorption spectra of the interaction between DNA and antiyeast substance produced by ALAC-4 at different time

由圖3和圖4可以看出,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),紫外吸收值有逐漸升高的趨勢(shì),產(chǎn)生了增色效應(yīng)。圖3的最大吸收峰由265 nm移到了261 nm,圖4的最大吸收峰由260 nm移到了257 nm。

這可能是由于抑菌物質(zhì)和DNA作用時(shí)間延長(zhǎng),抑菌物質(zhì)不僅與DNA表面的磷酸基團(tuán)發(fā)生了作用,而且抑菌物質(zhì)可能部分結(jié)構(gòu)嵌入DNA分子溝槽中,使DNA收縮的構(gòu)象趨于松散,所以又發(fā)生增色效應(yīng)[10]。

2.2抑菌物質(zhì)與DNA結(jié)合的熒光光譜

按照1.2.4方法測(cè)定抑菌物質(zhì)與DNA結(jié)合的熒光光譜,結(jié)果見圖5、圖6。

圖5　ALAC-3產(chǎn)抑菌物質(zhì)與DNA相互作用的熒光光譜Fig.5　Fluorescence spectra of the interaction between DNA and antiyeast substance produced by ALAC-3

圖6　ALAC-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)與DNA相互作用的熒光光譜Fig.6　Fluorescence spectra of the interaction between DNA and antiyeast substance produced by ALAC-4

從圖中可以看出,ALAC-3和ALAC-4在未加抑菌物質(zhì)的熒光光譜中,其最高熒光強(qiáng)度均為349 nm,且在掃描范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)微弱的下降趨勢(shì)。加入抑菌物質(zhì)后,隨著抑菌物質(zhì)濃度的增加,熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),各濃度的熒光光譜形狀相似且ALAC-3和ALAC-4的最高熒光強(qiáng)度分別在424 nm和423 nm處。ALAC-4熒光強(qiáng)度增加的程度高于ALAC-3,說明ALAC-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)酵母菌DNA的作用大于ALAC-3。

抑菌物質(zhì)與DNA的結(jié)合主要有嵌入、溝槽結(jié)合和靜電作用[11-13]。嵌入可以導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng),當(dāng)DNA與抑菌物質(zhì)相互作用后,最高峰處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),說明抑菌物質(zhì)與DNA發(fā)生了較強(qiáng)的結(jié)合作用?？赡苡捎谝志镔|(zhì)中的氨基酸殘基嵌入DNA雙螺旋鏈中與堿基對(duì)之間形成堆積效應(yīng)或處于DNA作用面的疏水環(huán)境中,導(dǎo)致DNA熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[9]。這與之前紫外光譜法的檢測(cè)結(jié)果相一致。

2.3抑菌物質(zhì)對(duì)復(fù)合體系EB-DNA相互作用的熒光光譜

EB是一種靈敏度高、選擇性好的熒光探針,在水溶液中本身的熒光很弱,當(dāng)它通過以較高的親合力、嵌入的方式與雙鏈DNA結(jié)合時(shí),其熒光強(qiáng)度大幅度增強(qiáng)[14]。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了熒光激發(fā)波長(zhǎng)為310 nm,熒光發(fā)射波長(zhǎng)為330～550 nm范圍的熒光光譜,從而觀察抑菌物質(zhì)對(duì)EB-DNA復(fù)合體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果見圖7、圖8。

圖7　ALAC-3產(chǎn)抑菌物質(zhì) 對(duì)復(fù)合體系EB-DNA相互作用的熒光光譜Fig.7　Fluorescence spectra of the interaction between EB-DNA and antiyeast substance produced by ALAC-3

圖8　ALAC-4產(chǎn)抑菌物質(zhì) 對(duì)復(fù)合體系EB-DNA相互作用的熒光光譜Fig.8　Fluorescence spectra of the interaction between DNA and antiyeast substance produced by ALAC-4

由圖7和圖8可以看出,ALAC-3和ALAC-4的EB-DNA體系的熒光特征峰分別為425 nm和426 nm。在熒光特征峰處,隨著抑菌物質(zhì)濃度的增加,熒光強(qiáng)度明顯降低且ALAC-4降低的幅度大于ALAC-3,說明ALAC-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)取代EB進(jìn)而與DNA結(jié)合的能力強(qiáng)于ALAC-3。

EB與DNA的結(jié)合的可能方式主要有:與帶負(fù)電荷的DNA骨架磷酸基團(tuán)之間的靜電作用以及與DNA溝槽的嵌入作用。因此可以通過測(cè)定EB-DNA體系的熒光光譜來觀察熒光強(qiáng)度的變化,進(jìn)而確定抑菌物質(zhì)與DNA的結(jié)合方式[6]。這表明加入的抑菌物質(zhì)與EB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA,抑菌物質(zhì)取代了EB-DNA體系中的EB,從而使熒光強(qiáng)度降低[6]。這充分說明抑菌物質(zhì)與酵母菌DNA發(fā)生了嵌入結(jié)合。

2.4EB對(duì)復(fù)合體系抑菌物質(zhì)-DNA相互作用的熒光光譜

用不同濃度的EB與抑菌物質(zhì)-DNA復(fù)合體系反應(yīng),從而研究了熒光光譜的變化。結(jié)果見圖9、圖10。

圖9　ALAC-3 EB對(duì)復(fù)合體系抑菌物質(zhì)-DNA 相互作用的熒光光譜Fig.9　Fluorescence spectra of the interaction between EB and ALAC-3 antiyeast substance-DNA

圖10　ALAC-4 EB對(duì)復(fù)合體系抑菌物質(zhì)-DNA 相互作用的熒光光譜Fig.10　Fluorescence spectra of the interaction between EB and ALAC-4 antiyeast substance-DNA

從圖9和圖10中可以看到,隨著EB濃度的增大,抑菌物質(zhì)-DNA復(fù)合體系的特征熒光峰逐漸升高,這表明EB逐漸取代了抑菌物質(zhì),形成了EB-DNA的復(fù)合體系,從而使熒光峰升高。結(jié)果說明了溶液體系存在抑菌物質(zhì)-DNA與EB-DNA兩個(gè)復(fù)合體系競(jìng)爭(zhēng)。

3　結(jié)論

本研究通過紫外光譜和熒光光譜法研究了乳桿菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)與酵母菌DNA的相互作用機(jī)制,結(jié)果顯示乳桿菌所產(chǎn)抑菌物質(zhì)可與酵母菌DNA發(fā)生相互作用。酵母菌DNA與乳桿菌所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)反應(yīng)后,其紫外吸收值減小,產(chǎn)生了減色效應(yīng);隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),紫外吸收值增加,呈現(xiàn)增色效應(yīng),說明抑菌物質(zhì)與酵母菌DNA表面的磷酸基團(tuán)通過靜電作用相結(jié)合,使DNA的空間構(gòu)象發(fā)生變化,再進(jìn)一步與DNA雙螺旋鏈的溝槽結(jié)合。抑菌物質(zhì)與酵母菌DNA反應(yīng),其熒光強(qiáng)度降低,說明抑菌物質(zhì)與酵母菌DNA之間存在嵌入作用。抑菌物質(zhì)與EB-DNA復(fù)合體系反應(yīng),其熒光強(qiáng)度降低,說明抑菌物質(zhì)取代EB與酵母菌DNA結(jié)合。EB與抑菌物質(zhì)-DNA復(fù)合體系反應(yīng),其熒光強(qiáng)度增加,說明溶液體系存在抑菌物質(zhì)-DNA與EB-DNA兩個(gè)復(fù)合體系競(jìng)爭(zhēng)。通過紫外光譜和熒光光譜顯示,ALAC-4對(duì)酵母菌DNA的作用大于ALAC-3。

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Study on unteraction mechanism of antiyeast substance produced by lactobacillus and the yeast DNA

CHEN Zhong-jun,LIU Jing

(Inner Mongolia Agricultural University,College of food science and Engineering,Hohhot 010018,China)

Two strains of lactobacillus ALAC-3 and ALAC-4 being of strong antiyeast ability were studied. TakingCandidaalbicansas the indicator strain,the interaction of antiyeast substance produced by lactobacillus and yeast DNA was investigated by ultraviolet spectrometry and fluorescence spectrometry. The results showed that the ultraviolet absorption value was decreased significantly and hypochromism were observed after adding anti-bacterial substances. With the extension of time,the ultraviolet absorption value was increased and hyperchromism were observed. The fluorescence intensity was decreased after adding anti-bacterial substances. When anti-bacterial substances and EB-DNA was reacted with each other,the fluorescence intensity was decreased significantly. And the fluorescence intensity was increased after EB and anti-bacterial-DNA was reacted. It indicated that there was the competition of anti-bacterial-DNA and EB-DNA in the solution system.

Lactobacillus;antiyeast substance;DNA;UV spectrometry;fluorescence spectrometry

2015-08-31

陳忠軍(1971-)，女，博士，教授，從事食品微生物及發(fā)酵工程的研究，E-mail：nmndchen@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260390)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0159-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.022