Parimi Leela Rani　付希安　王真真　楊寶琦　施仲香　劉　紅　張福仁1，

·論著·

播散性淺表性光化性汗孔角化癥MVK基因突變檢測

Parimi Leela Rani1，2#付希安1，2，3#王真真3楊寶琦3施仲香3劉紅3張福仁1，3

目的：檢測2個中國漢族播散性淺表性光化性汗孔角化癥（DSAP）家系患者MVK基因突變。方法： 提取2個DSAP家系及100名無親緣關(guān)系的健康對照外周血DNA，采用PCR擴增患者MVK基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，用Sanger測序法對PCR擴增產(chǎn)物直接測序檢測基因突變。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)1個新的剪切位點突變（c.1040-2A＞C）和1個已報道的錯義突變（c.1094T＞C）。結(jié)論：本研究進一步證實MVK基因突變與DSAP發(fā)病相關(guān)。

播散性淺表性光化性汗孔角化癥； MVK基因； 基因突變

播散性淺表性光化性汗孔角化癥（disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP）是汗孔角化癥最常見的類型［1］，1969年由Anderson等［2］首次描述，屬常染色體顯性遺傳。DSAP皮損以曝光部位數(shù)量較多，形態(tài)不規(guī)則，中央輕度萎縮，邊緣呈嵴狀隆起的淺褐色離心性環(huán)狀斑為特征，典型的病理特點為角化不全柱。該病具有遺傳異質(zhì)性，既往曾有多個致病區(qū)域被報道。2012年國內(nèi)學者通過外顯子測序研究發(fā)現(xiàn)MVK基因突變可導(dǎo)致本病的發(fā)生［3］。MVK位于12q24，包含10個編碼的外顯子及1個不編碼的外顯子，對角質(zhì)形成細胞的分化有著主要影響。本研究收集2個DSAP家系患者，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及DNA直接測序?qū)VK基因進行了檢測，以期發(fā)現(xiàn)其是否存在新的突變位點。

1　資料與方法

1.1臨床資料 本研究對象為2個DSAP家系（圖1）。2個先證者均由山東省皮膚病性病防治研究所的皮膚科專家結(jié)合臨床和組織病理學檢查診斷為DSAP患者。此外，我們選取了100名與DSAP患者無血緣關(guān)系的正常對照。

1.2試驗材料 外周血DNA的提取:經(jīng)患者和正常對照知情同意后，留取詳細的臨床資料和臨床圖片及組織病理檢查結(jié)果，同時取患者及家系正常個體靜脈血各5 mL，放置在EDTAK2抗凝管中，存入-80℃冰柜冷凍保存，采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA。取適量DNA進行純度檢測并標化。

1.3方法 MVK基因全部外顯子的PCR擴增參照文獻設(shè)計特異性引物10對［4］，擴增包括10個外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)的序列。PCR反應(yīng)在9700型PCR擴增儀（美國ABI公司）上完成。擴增條件: 94℃預(yù)變性3 min后，94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)。最后72℃延伸8 min，4℃保存?？偡磻?yīng)體系25 μL。純化后的PCR產(chǎn)物采用3130xl遺傳分析儀（美國ABI公司）直接測序。

圖1　2個DSAP家系的家系圖

2　結(jié)果

通過對MVK基因整個編碼區(qū)的10條外顯子及其側(cè)翼序列直接測序發(fā)現(xiàn):家系1先證者及家系內(nèi)其他患者均在10號內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)1個新的剪切位點突變（c.1040-2A＞C）（圖2）；家系2先證者及家系內(nèi)其他患者均發(fā)現(xiàn)一個既往報道的錯義突變（c.1094T＞C）（圖3），導(dǎo)致苯丙氨酸突變成絲氨酸（p.Phe364Ser）。以上突變均經(jīng)反向測序證實。家系中未發(fā)病成員及正常對照組經(jīng)測序均未發(fā)現(xiàn)以上突變。

圖2　A.家系1先證者MVK基因突變c.1040-2A＞C，位于11號外顯子上游2個堿基，為剪切位點突變；B.正常對照的測序結(jié)果

圖3　A.家系2先證者MVK基因突變c.1094T＞C，位于11號外顯子，為錯義突變；B.正常對照的測序結(jié)果

3　討論

DSAP是一種表現(xiàn)為皮膚角化異常的常染色體顯性遺傳病，具有遺傳異質(zhì)性，其遺傳學基礎(chǔ)和發(fā)病機制尚未完全明確。傳統(tǒng)基因檢測方法共定位了DSAP的5個致病區(qū)域12q23.2-24.1，1p31.3-p31.1，18p11.3，16q24.1-24.3，12q21.2-24.21［5-9］，但未發(fā)現(xiàn)其致病基因。2012年，國內(nèi)學者首次通過外顯子測序方法對一個DSAP家系進行研究，發(fā)現(xiàn)一個新的致病基因MVK，并在57個DSAP家系及25個散發(fā)DSAP患者中進行了驗證，結(jié)果在33%的家系和16%的散發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)了13個MVK基因突變位點［3］。2014年，國內(nèi)其他學者采用同樣方法，對2個DSAP家系患者進行分析，發(fā)現(xiàn)另外一個新的致病基因SLC17A9［10］。迄今，國內(nèi)外尚無其他團隊對SLC17A9基因在汗孔角化癥中進行驗證。2015年，Zhang等，通過連鎖分析、候選基因方法及MiSeq二代測序技術(shù)對134例（61例家系，73例散發(fā)）汗孔角化癥進行研究，發(fā)現(xiàn)了除MVK外的其它3個新的致病基因（PMVK，MVD，F(xiàn)DPS）［11］。以上4個基因均位于甲戊二羥酸途徑合成類異戊二烯通路上，該通路在細胞生成過程中有著重要的影響。但本研究只對汗孔角化癥進行致病基因研究，并未進行臨床型別分析。

MVK作為DSAP發(fā)病明確的致病基因，迄今共發(fā)現(xiàn)40余種突變位點［4，11-13］。該基因位于12q24，包含10個編碼的外顯子及1個不編碼的外顯子。MVK基因共存在四個保守區(qū)域，包括位于N端的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域及C端的PTS2結(jié)構(gòu)域。在人體的多個組織中MVK都有表達，其中包括皮膚的表皮細胞，而且MVK編碼的是甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶，此通路在細胞生成過程中有著重要的影響，提供許多細胞所必須的基本活性物質(zhì)。Zhang等采用建立細胞模型的方法來分析研究MVK基因在角質(zhì)形成細胞的增殖、分化、凋亡過程中的影響。研究發(fā)現(xiàn):MVK對角質(zhì)形成細胞增殖影響的研究中，實驗組和對照組之間并沒有顯著的統(tǒng)計學差異；但MVK對角質(zhì)形成細胞的分化有著主要影響，當MVK過度表達時，棘層的角質(zhì)形成細胞分化標志-角蛋白1表達增多，顆粒層分化標志蛋白也表達增多，而且通過流式細胞儀檢測到MVK的表達能夠有效地保護細胞免于UVB引起的細胞凋亡［3］。

本文通過對2個DSAP家系進行MVK致病基因突變研究，檢測到一個新的剪切位點突變和一個既往報道的點突變。以上2個突變均位于MVK基因第四個保守區(qū)域之內(nèi)，此區(qū)域內(nèi)的突變可能會影響角質(zhì)形成細胞的分化及由UVB所導(dǎo)致的細胞凋亡的升高。本研究進一步證實MVK基因突變與DSAP發(fā)病相關(guān)。

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（收稿:2016-01-18）

Mutation detection of MVK gene with disseminated superficial actinic porokeratosis

Parimi Leela Rani1，2，F(xiàn)U Xi'an1，2，3，WANG Zhenzhen3，YANG Baoqi3，SHI Zhongxiang3，LIU Hong3，ZHANG Furen1，3.
1.Shandong Provincial Hospital for Skin Diseases，Affiliated to Shandong University，Jinan 250022，China；2. School of Medicine，Shandong University，Jinan250000，China；3.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250022，China
Corresponding author:Zhang Furen，E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective:To detect mutations of MVK gene in 2 familial patients with disseminated superficial actinic porokeratosis（DSAP）.Methods:Polymerase chain reaction and direct sequencing were performed in the 2 DSAP families and 100 healthy controls to identify the mutations of MVK gene.Results:One novel splicing mutation（c.1040-2A＞C）and one reported missense mutation（c.1094T＞C）were identified. Conclusion:This study further confirms that MVK is associated with the onset of DSAP，which contributes further to the understanding of the pathogenesis of DSAP.

DSAP；MVK gene；mutations

山東省自然科學基金青年基金（編號:ZR2012HQ031）

1山東省皮膚病醫(yī)院，山東大學，濟南，250022 2山東大學醫(yī)學院，濟南，250000 3山東省皮膚病性病防治研究所，山東省醫(yī)學科學院，濟南，250022

張福仁，E-mail:zhangfuren@hotmail.com

#并列第一作者