應以堅，周丹丹，王雪奇（.臺州市環(huán)境監(jiān)測中心站； .臺州市環(huán)境科學設計研究院，浙江 臺州 8000；.杭州友源環(huán)保科技有限公司，杭州 0000）

產細菌纖維素菌培養(yǎng)基的研究探討

應以堅1，周丹丹2，王雪奇3
（1.臺州市環(huán)境監(jiān)測中心站； 2.臺州市環(huán)境科學設計研究院，浙江 臺州 318000；3.杭州友源環(huán)?？萍加邢薰荆贾?310000）

本文研究產了纖維素菌培養(yǎng)基的優(yōu)化，選取葡萄糖為碳源，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀為不同氮源，選擇最佳pH值。通過分析培養(yǎng)基的纖維素膜重、pH值、總酸、殘?zhí)恰D值，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源，以牛肉膏為氮源，pH值為5時，纖維素菌生長情況比較好，而且纖維素產量也比較高。

纖維素菌；培養(yǎng)基；研究探討

0　引言

細菌纖維素的生物合成是一個復雜的過程，為了提高其產量可以從多方面人手，找尋其它適合的菌株和比較合適的有利于菌體生長的條件以及發(fā)酵方式是一個比較可行的途徑。在發(fā)件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面，我們采取了Placket.Burrnan試驗設計和響應面分析方法。在本次試驗中通過培養(yǎng)基條件的優(yōu)化，來提高細菌纖維素的產量。在培養(yǎng)基條件優(yōu)化方面選取了幾個不同的因素，以葡萄糖為碳源時，分別選取氮源、培養(yǎng)基的PH值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

菌種：木醋桿菌，為本實驗室的保藏菌種。

1.1.2試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸鎂、氫氧化鈉、生理鹽水、冰醋酸、醋酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鈉、濃鹽酸、亞甲基藍、甲基紅、酚酞、蒸餾水、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀。

1.1.3儀器

MJX型生化培養(yǎng)箱、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、無菌操作臺、立式高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、烘箱、水浴鍋、UV752型紫外分光光度計、pHS-3CA型pH計、PB303-N型電子精密天平等。

1.2實驗方法

種子培養(yǎng)基的配制：用分析天平準確稱取葡萄糖3g，蛋白胨0.75g，酵母浸膏0.75g，十二水合磷酸氫二鈉1.022g，一水檸檬酸0.189g，硫酸鎂0.0375g，配制成150ml的種子培養(yǎng)基，PH調至5，配置后放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。

菌體接種培養(yǎng)：在150ml種子培養(yǎng)基中接入少量紅茶菌，在28℃的搖床中震蕩培養(yǎng)，待種子培養(yǎng)液出現(xiàn)少量渾濁情況即可進行種子液的接種。

配制不同氮源培養(yǎng)基：用分析天平準確稱取葡萄糖1g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.0124g，以不同的氮源為變量，分別加入酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、脲、磷酸氫二銨、硝酸鉀各0.250g，配制成50ml的培養(yǎng)基，并把pH調至5，平行三組。

配制不同pH值的培養(yǎng)基：用分析天平準確稱取葡萄糖1g，蛋白胨0.250g，酵母浸膏0.250g，十二水合磷酸氫二鈉0.341g，一水合檸檬酸0.062g，硫酸鎂0.012g，配制成50ml的培養(yǎng)基，并把pH分別調至3，4，5，6，平行三組。

把配制好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋，在120℃下滅菌20min。滅完菌后在無菌操作臺進行種子液的接入，接種量為培養(yǎng)基含量的8%，即4ml。全部接好后，統(tǒng)一放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。

2　纖維素菌各理化指標測定

纖維素膜干重的測定：將平行組前兩組的纖維素膜從培養(yǎng)基中挑出然后用蒸餾水洗凈放進平板中用4.0%的NaOH浸末，在82℃下浸泡2h。用蒸餾水將纖維素膜洗至pH為7，放進烘箱干燥用差重法測干重。

pH的測定：用pH計測定培養(yǎng)液的pH值并記錄。

OD值的測定：平行組第三組的纖維素膜用蒸餾水洗凈，放入錐形瓶中加50ml醋酸鈉-醋酸緩沖液，再加2ml纖維素酶液放進搖床內振蕩，待纖維素膜全部溶解后過濾取濾液用紫外分光度計在600nm波長下測其吸光度并記錄。

總酸的測定：用10ml移液管取10ml培養(yǎng)液于100ml錐形瓶中，然后加50ml無二氧化碳水再加兩滴酚酞作指示劑，用NaOH標準液滴定至出現(xiàn)微紅色且30s內不褪色即為滴定終點，記錄堿式滴定管的始末讀數(shù)。

總糖的測定：用亞鐵氰化鉀法測定總糖的含量。分別配制好斐林甲液、好斐林乙液以及1g/L葡萄糖標準溶液。先做空白試驗。

3　結果與分析

3.1不同氮源對產纖維素菌的影響

表1　不同氮類對培養(yǎng)基總酸的影響

從圖可以看出以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基，產纖維素菌生長比較出色，但是產生的膜并沒有以牛肉膏為氮源的重，說明菌體長得越出色并不能代表它所產生的菌膜越多。培養(yǎng)基的pH值相差不多，總體來說，以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基更有利于產纖維素菌產膜。

3.2不同pH值對產纖維素菌的影響

表2　不同pH值對培養(yǎng)基總酸的影響

當培養(yǎng)基pH值為3時，產纖維素菌沒有生長，所以也沒有產膜，當pH值逐漸上升至5時，產纖維素菌生長最為旺盛，產生的膜也最多，消耗的糖也最多，pH升到6時，產纖維素菌生長情況開始下降。說明適合產纖維素菌生長的最佳pH是5。

4　結論

以葡萄糖為碳源時，以不同氮源，培養(yǎng)基pH值的條件為變量，培養(yǎng)產纖維素菌，通過測量分析各培養(yǎng)基的理化指標：膜干重，菌體濃度，總酸，殘?zhí)牵琾H值。綜上所述，以葡萄糖為碳源時，產纖維素菌最適生長和產膜的最適氮源是牛肉膏，最適pH值是5。

［1］茍金霞.醋酸菌生產細菌纖維素的研究［C］.陜西科技大學，2005：1-2.

［2］王淑芳，馬桂珍，石桐磊，暴增海.接種量和酸堿度對滑菇菌絲生長量的影響［J］.2011（21）：152-154.

10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.14.209