羅丹　高穎　丁曉芳　舒德峰　朱燕　李璐璐　鐘少紅

[摘要]目的：探討體外培養(yǎng)時不同氧濃度對體外受精一胚胎移植（in vitro fertilization-embryotransfer，IVF-ET）中胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。方法：將471例于2013年在本生殖中心行IVF-ET的患者，根據(jù)其體外培養(yǎng)的氧濃度將其隨機分為5%低氧濃度組（n=247）和20%高氧濃度組（n=224）。比較兩組間卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、著床率及活產(chǎn)率。結(jié)果：兩組間患者的卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、著床率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。但低氧濃度組的活產(chǎn)率顯著高于高氧濃度組（48.2%vs.38.4%，P<0.05）。結(jié)論：低氧濃度胚胎培養(yǎng)能夠改善IVF的妊娠結(jié)局。

[關(guān)鍵詞]氧濃度；體外受精；胚胎移植；活產(chǎn)率

[中圖分類號]R697 [文獻標(biāo)志碼]A

在生理條件下，胚胎置身于2%～8%的氧濃度中，但目前有不少輔助生殖技術(shù)實驗室是在大氣氧濃度（約20%）下培養(yǎng)胚胎。已經(jīng)有很多哺乳動物實驗證明，在這種超生理濃度的氧分壓下培養(yǎng)胚胎會影響胚胎的代謝、發(fā)育及相關(guān)基因表達。而關(guān)于高氧濃度培養(yǎng)對人類胚胎的影響方面的研究仍相當(dāng)有限，并且結(jié)果尚不一致。有些研究顯示低氧濃度培養(yǎng)可以提高IVF/ICSI的著床率、妊娠率和活產(chǎn)率，但另一些研究則顯示降低氧濃度未能顯著提高胚胎的質(zhì)量、著床率和妊娠率。本研究旨在探討低氧濃度下培養(yǎng)人類胚胎能否改善IVF的妊娠結(jié)局。

1 資料和方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隨機對照研究。選擇于2013年1月至12月在本中心行標(biāo)準(zhǔn)長方案IVF-ET治療的患者進行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡在20～35歲之間；（2）首次行IVF-ET助孕的患者：（3）基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）<10 IU/L，基礎(chǔ)黃體生成激素（LH）<10 IU/L；（3）患者的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）≤23 kg/m²。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有習(xí)慣性流產(chǎn)病史；（2）縱隔子宮、雙子宮等子宮畸形；（3）子宮肌瘤、子宮腺肌病等影響宮腔形態(tài)的疾病。該研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。符合條件的患者共471例，根據(jù)進入治療周期的順序按隨機數(shù)字法分為5%低氧濃度組（研究組）和20%高氧濃度組（對照組）。低氧濃度組置于5%的氧氣濃度下，高氧濃度組置于20%的氧氣濃度下。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵方案 兩組對象均采用標(biāo)準(zhǔn)長方案進行促排卵，于前一月經(jīng)周期的黃體中期開始注射GnRHa進行降調(diào)節(jié)。月經(jīng)來潮后根據(jù)降調(diào)水平開始以Gn啟動，利用B超和血清激素水平檢測卵泡發(fā)育。當(dāng)達到取卵標(biāo)準(zhǔn)時，于當(dāng)晚8時左右注射HCG 10000 IU促進卵泡的最后成熟，34～36 h后在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。

1.2.2 胚胎培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)評分 卵子和胚胎培養(yǎng)均采用瑞士Vitrolife公司的G系列序貫培養(yǎng)液。取卵后將研究組的卵母細胞置于氧氣濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱（5%CO₂+5%O₂+90%N₂，Benchtop培養(yǎng)箱，COOK公司，澳大利亞）中培養(yǎng)：而對照組則置于氧氣濃度為20%的單氣培養(yǎng)箱（5%CO₂+空氣，Gal-axy S+培養(yǎng)箱，RS Biotech公司，英國，三氣培養(yǎng)箱生產(chǎn)批號AC855498，單氣培養(yǎng)箱生產(chǎn)批號16895）。取卵后3～4h行常規(guī)體外授精，受精18-20h后，觀察原核判斷受精情況。于受精后第2d、第3d對胚胎進行形態(tài)學(xué)評分。Ⅰ級：胚胎卵裂球均勻規(guī)則，胞質(zhì)均質(zhì)透明，透明帶完整，胚胎無或僅有極少（<5%）碎片：Ⅱ級：卵裂球形態(tài)輕度不均勻，胞漿折光性有輕微變化，碎片<20%，透明帶完整；Ⅲ級：胚胎內(nèi)碎片<50%，其余卵裂球形態(tài)同Ⅱ級；Ⅳ級：胚胎內(nèi)碎片>50%，碎片外卵裂球具有活細胞特征，胞漿折光性有較大改變，胞漿變黑顆粒不均勻。Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.2.3 胚胎移植及妊娠結(jié)局判斷 于受精后第3d根據(jù)患者年齡、周期及胚胎情況選擇形態(tài)評分最佳的1～3枚胚胎進行移植，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)至第7d，將優(yōu)質(zhì)囊胚進行冷凍保存，囊胚培養(yǎng)均在氧氣濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中進行。移植后14d查血HCG確定生化妊娠，30d行B超檢查，見孕囊及胎兒心管搏動確定臨床妊娠。

1.2.4 觀察指標(biāo) 記錄患者的一般情況（年齡、BMI、不孕年限、獲卵數(shù)），實驗室指標(biāo)（卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率）及妊娠結(jié)局（臨床妊娠率、著床率及活產(chǎn)率）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.O軟件包進行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)之間的比較采用t檢驗，率的比較采用x²檢驗，P<0.05說明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

2013年1月至12月被納入研究組患者共247例，對照組224例。兩組患者之間的平均年齡、BMI、不孕年限、平均獲卵數(shù)均無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.2 實驗室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較

兩組患者的卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、著床率均無顯著性差異（P>0.05），但研究組的活產(chǎn)率顯著高于對照組（P<0.05）。見表2。

3 討論

在大氣氧濃度下進行胚胎培養(yǎng)能夠增加活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的產(chǎn)生，而高濃度的ROS能夠損傷細胞器及細胞膜，對DNA產(chǎn)生直接或間接的破壞，并且能改變基因表達。通過降低氧濃度是否可以減少這些負面效應(yīng)，臨床研究的結(jié)果尚不一致。多數(shù)研究認為低氧培養(yǎng)環(huán)境有利于改善妊娠結(jié)局，但也有研究未發(fā)現(xiàn)臨床結(jié)局有改善。

Kea等的研究得出低氧濃度的培養(yǎng)環(huán)境對IVF/ICS[周期的受精率、囊胚形成率和妊娠率均無顯著性改善。Dumoulin等“也沒有發(fā)現(xiàn)低氧對于胚胎培養(yǎng)的優(yōu)勢。Bahceci等發(fā)現(xiàn)5%氧環(huán)境下第3d的胚胎評分顯著高于20%氧濃度，但臨床結(jié)局無顯著性差異。本研究的結(jié)果雖然在胚胎的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、臨床妊娠率及著床率等方面沒有顯示出差異，但低氧培養(yǎng)組的活產(chǎn)率顯著高于高氧濃度組?；町a(chǎn)率的提高從臨床最終結(jié)局方面說明了低氧濃度培養(yǎng)的優(yōu)勢。

Ciray等將進行ICSI治療的同一個患者卵子隨機放入5%氧濃度和20%氧濃度的培養(yǎng)箱中，觀察到5%氧濃度下第3d的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)和第6d的囊胚形成數(shù)顯著增多，認為生理氧濃度更適合胚胎的整個體外培養(yǎng)過程。本研究并沒有觀察到這種差異，分析其原因，可能與以下幾點有關(guān)：（1）本研究選擇的病例為常規(guī)IVF患者，其卵冠丘復(fù)合物周圍的顆粒細胞對卵子提供了一定的保護作用，可以中和一部分ROS帶來的損傷，所以在胚胎培養(yǎng)的早期我們可能不易觀察到這種差異；（2）培養(yǎng)液成分的不同，由于我們使用的是商業(yè)化試劑，不同的試劑種類其中所添加的抗氧化劑成分和量也許存在差異：（3）胚胎評價系統(tǒng)的差異，目前胚胎評價系統(tǒng)主要是根據(jù)卵裂球的數(shù)目、均勻程度以及無核碎片的比例等參數(shù)來判斷，跟觀察者的主觀判斷有很大關(guān)系：（4）樣本量的差異。

目前這些研究主要關(guān)注于胚胎的形態(tài)學(xué)和著床情況，將來的研究應(yīng)該更加關(guān)注于一些其他的反應(yīng)胚胎潛能的指標(biāo)，比如基因表達的改變或者表觀遺傳學(xué)的差異。Rinaudo等對鼠胚的研究顯示，5%氧濃度下培養(yǎng)的鼠胚其基因表達圖譜更接近于體內(nèi)發(fā)育的胚胎。Katz-Jaffe等的研究則顯示低氧環(huán)境下胚胎的蛋白組學(xué)分析更接近于體內(nèi)發(fā)育的胚胎。還有一項研究顯示，在培養(yǎng)液中加入血清可以影響基因印記的表達，血清暴露的小鼠在20月齡時其心臟和肝臟重量高于對照組，并且顯示出行為異常和記憶力缺陷。

綜上所述，本研究顯示低氧濃度培養(yǎng)可以提高IVF-ET周期的活產(chǎn)率，但仍需進行大樣本的隨機對照研究來發(fā)現(xiàn)其差異，并且今后的研究應(yīng)該進一步從分子水平來闡明不同氧濃度對胚胎發(fā)育的影響機制，從而改善IVF結(jié)局。

（收稿日期：2015-10-10）endprint