謝　偉，秦雯，蔣凌云，莫馥華，朱時敏，顧克英，羅遠富，覃愛平△（.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)生殖中心，廣西南寧500；.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧500；.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧500）

·論著·

優(yōu)化胰蛋白酶消化強度進行人子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)技術(shù)探討*

謝偉1，秦雯2，蔣凌云1，莫馥華1，朱時敏3，顧克英3，羅遠富3，覃愛平1△（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)生殖中心，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021）

目的探討優(yōu)化改良的人子宮內(nèi)膜原代上皮細胞培養(yǎng)技術(shù)。方法將2014年7月1日至2014年9月30日需行診斷性清宮術(shù)的患者21例分為0.125%胰蛋白酶組（A組）、0.250%胰蛋白酶組（B組）和1 mg/mL膠原酶組（C組）。同時結(jié)合使用100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)進行子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)細胞分離，比較各組間子宮內(nèi)膜上皮細胞純度和生長狀態(tài)。結(jié)果子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)成功19例，A組子宮內(nèi)膜組織污染1例，C組因細胞量過少接種失敗1例。細胞獲得后培養(yǎng)進行上皮細胞團百分比計算，A組為（85.71±1.38）%、B組為（75.28±1.50）%和C組為（84.86± 2.34）%，其中A組和C組的上皮細胞百分比高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細胞培養(yǎng)3～5 d后待細胞基本鋪滿培養(yǎng)孔，免疫組化辣根過氧化物酶底物顯色（ABC法）進行純度檢測，A組為（90.28±2.13）%、B組為（84.57±2.76）%和C組為（86.14±4.06）%，A組細胞純度均大于B、C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A組子宮內(nèi)膜上皮細胞獲得數(shù)量和純度均高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論0.125%胰蛋白酶消化子宮內(nèi)膜組織結(jié)合100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)過濾，可以穩(wěn)定地獲得質(zhì)量良好的子宮內(nèi)膜上皮原代細胞。

子宮內(nèi)膜；上皮細胞；細胞培養(yǎng)技術(shù)；胰蛋白酶

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.11.002

A

1009-5519（2016）11-1606-03

子宮內(nèi)膜上皮細胞是胚胎著床最先接觸的部位，也是婦女月經(jīng)周期變化的基礎(chǔ)。對子宮內(nèi)膜組織及細胞的研究是深入了解婦科疾病發(fā)病機制的重要手段，但由于臨床患者婦科疾病的特點及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的限制，子宮內(nèi)膜組織來源有限，單純臨床研究受到很大限制，所以子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)是研究子宮內(nèi)膜功能和基因調(diào)控的重要輔助手段。而人子宮內(nèi)膜上皮細胞原代培養(yǎng)一直存在材料標本容易污染，細胞分離困難、純度低、生長緩慢及傳代效果不良等諸多問題［1］。最常見的子宮內(nèi)膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法主要有酶消化、篩網(wǎng)過濾/離心等。酶消化分離純化方法有膠原酶消化后分離純化上皮細胞［2］或多種消化酶聯(lián)合使用，如膠原酶、胰酶或分支酶按配方使用［3］，但試劑具有較昂貴、上皮細胞收獲小及間質(zhì)細胞多等缺點，篩網(wǎng)過濾有不同孔徑規(guī)格，需要配合優(yōu)化使用，而離心法相對要復(fù)雜一些。本文將從人子宮內(nèi)膜的取材、細胞分離、純化及培養(yǎng)等方面進行一些改良，從而獲得較為滿意的原代子宮內(nèi)膜上皮細胞，經(jīng)過培養(yǎng)和純化的子宮內(nèi)膜上皮細胞可為下一步的細胞生長、分化、代謝及鑒定等實驗打下良好基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源選擇2014年7月1日至2014年9月30日在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診需行診斷性清宮術(shù)的21例患者作為研究對象，所有患者診斷取材均進行談話、詳細交代手術(shù)及實驗過程，并簽訂同意書。組織標本部分送病理檢查，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確定，其中增生期15例，分泌期6例。剩余子宮內(nèi)膜標本經(jīng)過整刮取材，去除大塊血塊及組織黏液，置專用細胞培養(yǎng)液中于4℃保存，30 min內(nèi)直接送實驗室做進一步處理。

1.1.2試劑PRMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），四季青牌胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司），鼠抗人角蛋白抗體（Abcam公司），鏈霉素-生物素-過氧化物酶標記羊抗鼠試劑盒（北京中杉公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo），超凈工作臺（蘇州凈化公司）。

1.2方法

1.2.1人子宮內(nèi)膜上皮細胞分離和純化人子宮內(nèi)膜組織標本進入實驗室后，余下所有細胞培養(yǎng)實驗均在細胞培養(yǎng)室完成，嚴格按照細胞培養(yǎng)常規(guī)操作流程完成。首先予以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)沖洗，再去除一些小的血塊和黏液。轉(zhuǎn)入清潔滅菌小瓶，將子宮內(nèi)膜組織剪碎成約1 mm3大小組織塊，按照實驗分組給予一定濃度胰蛋白酶或膠原酶，在37℃下消化2～4 h，期間間隔1～5 min吹打組織1次，保證消化、分離細胞充分。根據(jù)預(yù)實驗和參照文獻［4］按照消化子宮內(nèi)膜組織的胰蛋白濃度分組，具體如下：0.125%胰蛋白組（A組）7例（增生期5例，分泌期2例），消化時間 2～4 h；0.250%胰蛋白組（B組）7例（增生期6例，分泌期1例），消化時間2～4 h；1 mg/mL膠原酶組（C組）7例（增生期4例，分泌期3例），消化時間為1 h。以胎牛血清終止消化后，1000r/min離心，棄上清液，三組均再將沉淀分別予以100目濾網(wǎng)（150μm）及400目（38μm）濾網(wǎng)充分過濾。

1.2.2人子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液反復(fù)沖洗400目（38 μm）過濾網(wǎng)，其中剩下的組織細胞團大部分為上皮細胞團，初步細胞計數(shù)后按每毫升5×106個細胞密度將其接種于6孔細胞培養(yǎng)板，需進行免疫組化等檢查的孔內(nèi)置放小玻璃片，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)液選擇使用改良的專用上皮細胞培養(yǎng)液（PRMI1640培養(yǎng)基），加入15%胎牛血清和0.5 mL青霉素-鏈霉素雙抗。每天觀察細胞生長情況，定期換液。

1.2.4人子宮內(nèi)膜上皮細胞傳代倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)孔細胞生長到密度約90%時可以進行細胞形態(tài)總結(jié)和純度檢測。

1.2.5子宮內(nèi)膜上皮免疫組化檢查當(dāng)細胞基本長滿后取出蓋玻片，以0.01 mol/L PBS洗滌2次，用多聚甲醛固定后，使用鼠抗人細胞角蛋白一抗作用，并設(shè)陰性對照（PBS）（4℃過夜），使用鏈霉素-生物素-過氧化物酶標記羊抗鼠試劑盒進行實驗，再用蘇木素復(fù)染。細胞質(zhì)被染成棕黃色的細胞為陽性細胞。三組每張片取10個不同的視野進行計數(shù)，統(tǒng)計上皮細胞和間質(zhì)細胞的比例。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1細胞培養(yǎng)結(jié)果細胞培養(yǎng)成功19例，A組子宮內(nèi)膜組織污染1例。C組因細胞量過少接種失敗1例。細胞獲得后種板前進行上皮細胞團百分比計算，A組為（85.71±1.38）%、B組（75.28±1.50）%和C組為（84.86± 2.34）%，其中A組和C組的上皮細胞百分比高于B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上皮細胞生長貼壁較慢，鋪滿6孔板需要3 d左右，而間質(zhì)細胞貼壁生長快，接種后0.5 h就可貼壁，生長迅速，若上皮細胞純度不夠，間質(zhì)細胞可嚴重干擾子宮內(nèi)膜上皮細胞生長。

2.2人子宮內(nèi)膜上皮細胞鑒定細胞形態(tài)學(xué)特征上皮細胞呈現(xiàn)多角形或蝌蚪形，成團或漩渦狀排列。細胞質(zhì)成細顆粒狀、核大、核仁明顯。免疫組織化學(xué)鑒定：腺體細胞團角蛋白染色為棕色顆粒，即為陽性細胞。見圖1～6。

2.3細胞純度檢驗培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細胞辣根過氧化物酶底物顯色（ABC法）進行免疫組化檢查，腺體細胞團角蛋白染色為棕色顆粒，計算10個視野中上皮細胞和間質(zhì)細胞的比例。各組上皮細胞純度檢測：A組為（90.28± 2.13）%、B組（84.57±2.76）%和C組（86.14±4.06）%，A組細胞純度均高于B、C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、2、3。

圖1　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞A組（100×）

圖2　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞B組（100×）

圖3　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞C組（100×）

圖4　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞A組（400×）

圖5　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞B組（400×）

圖6　子宮內(nèi)膜原代上皮細胞C組（400×）

3　討　論

子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)技術(shù)是研究子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)方法之一，獲得較高純度的原代上皮細胞有許多方法，但對于子宮內(nèi)膜上皮細胞體外培養(yǎng)體系尚有很多亟待解決的問題。其中消化酶的選擇就有多種，早在20世紀90年代就有胰蛋白酶使用的相關(guān)報道［5］。胰蛋白酶消化能力較強，因而較多地在細胞傳代中使用。胰蛋白酶是專一作用于有堿性氨基酸——精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵，具有較強的消化分離細胞的能力，是一種有利于分解上皮細胞間較多的緊密連接方式［6］。分析胰蛋白酶在人子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)中可行原因如下：（1）子宮內(nèi)膜上皮細胞成團狀，抗胰酶消化能力強，團塊中間的上皮細胞不易受到胰酶的消化、損害。（2）子宮內(nèi)膜組織基質(zhì)細胞豐富，且容易分散，而上皮細胞較少，成團塊，較難分散，2種細胞特性差異較大?；|(zhì)細胞承擔(dān)了大部分的胰酶消化能力，有利于保護上皮細胞，同時通過胰酶的強消化能力可以減少基質(zhì)細胞的數(shù)量，有利于細胞的純化。（3）子宮內(nèi)膜上皮細胞存在較多的緊密連接，不容易被分離，需要使用消化能力較強的酶。本實驗根據(jù)子宮內(nèi)膜上皮細胞的特點對胰蛋白酶的作用進行重點改進，主要是濃度調(diào)整、結(jié)合不同孔徑濾網(wǎng)過濾，以獲得最佳質(zhì)量的子宮內(nèi)膜上皮細胞。其中A組0.125%胰蛋白酶消化子宮內(nèi)膜組織，同時輔助100目濾網(wǎng)（150 μm）及400目（38 μm）濾網(wǎng)過濾來獲得子宮內(nèi)膜上皮細胞的方法經(jīng)濟實用，且不易出現(xiàn)過度消化的現(xiàn)象，這與相關(guān)報道結(jié)果相似［7-8］。

在子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)中分離細胞的數(shù)量是關(guān)鍵，細胞數(shù)太少容易引起種細胞失敗，細胞數(shù)太多可出現(xiàn)分離的細胞純度下降，所以要根據(jù)不同子宮內(nèi)膜組織量和消化個體差異，選擇不同的酶消化時間，既要充分消化，又要避免過度消化［9］。本實驗根據(jù)情況選擇2～4h，且需及時調(diào)整。

團塊狀分布的上皮細胞和間質(zhì)細胞的分離根據(jù)上皮細胞和間質(zhì)細胞的特性，上皮細胞容易成團分布，而間質(zhì)細胞分散分布，上皮細胞貼壁慢，而間質(zhì)細胞貼壁快，所以在用胰蛋白酶消化后需要使用一定孔徑的篩網(wǎng)進行過濾。但分離的孔徑和次數(shù)需要經(jīng)過探索，Sinha等［10］認為使用75 μm濾網(wǎng)一次過濾即可以獲得較多的間質(zhì)細胞，但上皮細胞較少。有文獻報道了38 μm濾網(wǎng)在子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)方面的作用［11-13］，本實驗使用150 μm和38μm 2種孔徑濾網(wǎng)進行子宮內(nèi)膜上皮細胞分離和培養(yǎng)，取得較好的子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)量和純度。150 μm用來除去血塊黏液雜質(zhì)和沒有起作用的消化大細胞組織團塊，38 μm用來分離子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞，從而達到較為滿意的效果。

在獲得子宮內(nèi)膜上皮細胞的質(zhì)量比較中，本研究發(fā)現(xiàn)，A組子宮內(nèi)膜上皮細胞的質(zhì)量最好、純度高，細胞培養(yǎng)密度均勻，見圖1、4。提示0.125%胰蛋白酶的良好消化作用，在細胞消化中掌握好消化時間，結(jié)合濾網(wǎng)過濾可以取得良好的細胞培養(yǎng)效果。

在細胞培養(yǎng)液的選擇方面，由于子宮內(nèi)膜上皮細胞生長比較緩慢，需要使用改良專用細胞培養(yǎng)液，除了在培養(yǎng)基選擇方面使用有利于上皮細胞生長的PRMI1640培養(yǎng)基外，還需要對胎牛血清濃度進行調(diào)整。本研究中加大了胎牛血清的濃度，在普通細胞培養(yǎng)的10%的基礎(chǔ)上加大了5%，給予細胞更充分的營養(yǎng)支持，使用發(fā)現(xiàn)上皮細胞生長較好，而并不會對后繼實驗造成影響［14］。

在防止細胞及取材污染方面，組織或細胞受到污染就意味著整個實驗的失敗，所以需要嚴格進行操作。在組織取材中，首先要進行仔細的外陰皮膚及陰道消毒準備，動作輕柔，嚴格按照無菌操作要求進行，取得組織材料后要及時送檢，4℃保存，取材組織器材和裝組織的材料要進過高壓滅菌消毒［15］。本研究中僅1例標本污染，事后分析是當(dāng)時時間較緊、裝組織材料的小瓶消毒不嚴格、送檢時間偏長所致，因此后續(xù)研究時需注意。

綜上所述，取材前嚴格無菌準備器械和材料，使用0.125%胰蛋白酶消化加150 μm和38 μm孔徑濾網(wǎng)過濾可以獲得較多的上皮細胞，同時適當(dāng)提高培養(yǎng)液的胎牛血清濃度有利于建立穩(wěn)定的原代子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)體系。

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Study on culture technology of human endometrial epithelial cells by optimizing trypsin digestion intensity*

Xie Wei1，

Qin Wen2，Jiang Lingyun1，Mo Fuhua1，Zhu Shimin3，Gu Keying3，Luo Yuanfu3，Qin Aiping1△（1.Reproduction Center，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China；2.Department of Pathology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital ofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China；3.GuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China）

ObjectiveTo investigate an optimized and improved culture technology of primary human endometrial epithelial cells.MethodsTwenty-one patients undergoing diagnostic uterine curettage from July 1 to September 30，2014 were divided into the 0.125%trypsin group（A），0.250%trypsin group（B）and 1mg/mL collagenase group（C）.Meanwhile 100-mesh strainer（150 μm）and 400-mesh strainer（38 μm）were used to separate the endometrial epithelial cells and interstitial cells.Then the cells purity and growth state were compared among various groups.ResultsNineteen cases succeeded in the endometrial epithelial cell culture.One case in the group A was contaminated by endometrial tissues，1 case in the group C failed in the inoculation due to too little cell amount.In conducting the epithelial cell cluster percentage calculation after obtaining cells and inoculating，the group A was（85.71±1.38）%，group B was（75.28±1.50）%and group C was（84.86±2.34）%，in which the percentage of epithelial cells in the group A and C was higher than that in the group B，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.After the cells basically overspread the culture holes by 3-5 d of cell culture，the purity was detected by using the immunohistochemistry ABC method，the group A was（90.28±2.13）%，group B was（84.57±2.76）%and group C was（86.14±4.06）%.The purity of the group A was higher than that of the group B and C，and the difference had statistic significance（P＜0.05）.The acquired endometrial epithelial cells amount and purity in the group A were higher than those in the other two groups，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion0.125%trypsin digesting endometrial tissues and combining with the filtration by 100-mesh strainer（150 μm）and 400-mesh strainer（38 μm）can stably acquire good-quality primary endometrial epithelial cells.

Endometrium；Epithealial cells；Cell cutture techniques；Trypsin

廣西優(yōu)秀博士論文培養(yǎng)計劃資助項目（YCBZ2014033）。

謝偉（1977-），副主任醫(yī)師，主要從事生殖醫(yī)學(xué)方面的工作。
△

，E-mail：fenglingcao1980@163.com。

（2016-02-27）