李秀英，葉云（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

·論著·

水飛薊賓對巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白的影響*

李秀英，葉云△
（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

目的探討水飛薊賓對巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及相關(guān)機制。方法以RAW264.7巨噬細胞為細胞模型，采用MTT法檢測水飛薊賓對巨噬細胞活性的影響；油紅O染色觀察水飛薊賓對巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的影響；Western blotting檢測水飛薊賓對巨噬細胞SR-A、CD36、c-fos、c-Jun蛋白表達的影響及c-Jun N端激酶抑制劑SP600125對水飛薊賓減少巨噬細胞CD36蛋白表達的影響。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，并采用雙尾t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)意義評估。結(jié)果12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓對巨噬細胞活性無影響；50.0μg/mL水飛薊賓顯著抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取［抑制率為（80.0±1.8）%］，從而減少巨噬細胞源性泡沫細胞的形成；12.5、25.0、50.0μg/mL的水飛薊賓劑量依賴性降低巨噬細胞CD36蛋白表達，12.5、25.0、50.0μg/mL的水飛薊賓組CD36蛋白量為對照組的（0.60±0.06）、（0.45±0.07）、（0.10±0.06）倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但對SR-A蛋白表達無影響；水飛薊賓劑量依賴性降低細胞核c-fos蛋白量，12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓組細胞核c-fos蛋白量是對照組的（0.50±0.05）、（0.40±0.06）、（0.30±0.05）倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SP600125與水飛薊賓共同孵育巨噬細胞后，CD36蛋白量降低為對照組的（0.20±0.06）倍，與水飛薊賓處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論水飛薊賓可抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成，且與抑制c-fos/CD36通路相關(guān)。

動脈粥樣硬化；巨噬細胞；泡沫細胞；脂蛋白類，LDL；水飛薊素

【Abstract】Objective To explore the effectsof Silibinin onmacrophage-derived foam cell formation and itsmechanisms. M ethods RAW 264.7 macrophagewas used as the cellmodel，the effectsof Silibinin on themacrophage viabilitywas examined by MTT；the oil-red O staining was used to observe the effects of Silibinin on the uptake of oxidized low density lipoprotein （oxLDL）inmacrophages；the effectsofSilibinin on SR-A，CD36，c-fos，c-Jun protein expression inmacrophages，and c-Jun N-terminalkinase inhibitor SP600125 on reduction of CD protein expression inmacroph ages were detected by using Western blotting. The datawere analyzed by using the SPSS10.0 statistical soft ware and the statistical significance was assessed by the two-tailed t test.Results 12.5，25.0，50.0μg/mL Silibinin had no effecton macrophage viability；50μg/mL Silibinin significantly inhibited the oxLDL up take by macrophages［inhibition rate of（80.0±1.8）%］，thus reduced the macrophage-derived foam cell for mation；12.5，25.0，50.0μg/mLSilibinin decreased themacrophage CD36 protein expression in a dose dependentmanner，the CD36 protein levels in 12.5，25.0，50.0μg/mLSilibinin groupswere（0.60±0.06），（0.45±0.07），（0.10±0.06）fold of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），but with out affecting the SR-A protein expression inmacrophages；Silibinin decreased nuclear c-fos protein in a dose dependentmanner，the nuclear c-fos protein levels in 12.5，25.0，50.0μg/mL Silibinin groups were（0.50±0.05），（0.40±0.06），（0.30±0.05）fold of the controlgroup，the differences were statistically significant（P＜0.05）；after the co-incubation with macrophagesby SP 600125 and Silibinin，the CD36 protein levelwas further decreased to（0.20±0.06）times of the control group，compared with the Silibinin-treated group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Silibinin could inhibit the formation of macrophage-derived foam cells，moreover which is possibly related with the inhibition ofc-fos/CD36 pathway.

【Key words】A therosclerosis；M acrophages；F oam cells；Lipoproteins，LDL；Silymarin

動脈粥樣硬化是以動脈壁脂質(zhì)聚集或炎癥發(fā)生為特征的慢性疾病，是不穩(wěn)定性心絞痛、心肌梗死的主要原因［1］。巨噬細胞源性泡沫細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。對氧化低密度脂蛋白（oxLDL）無限制的攝取是巨噬細胞成為泡沫細胞的重要原因［2］。清道夫受體SR-A及CD36是巨噬細胞攝取oxLDL的主要受體［3］。有研究顯示，減少SR-A、CD36的表達可以抑制泡沫細胞的形成并最終延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［4］。

水飛薊除了被廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的治療外，對心血管也有保護作用，如水飛薊可降低高脂動物血漿膽固醇和低密度脂蛋白水平［5］，抑制血管增生［6］，保護內(nèi)皮細胞［7］，改善腦缺血再灌注損傷的作用［8］。有研究顯示，水飛薊可抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的進展［9］。水飛薊賓作為水飛薊最主要的活性成分，其是否能抑制泡沫細胞形成達到抗動脈粥樣硬化的作用有待進一步研究。此外，有研究表明，c-Jun、c-fos與巨噬細胞CD36蛋白表達相關(guān)［2］。本研究擬從SR-A、CD36、c-Jun、c-fos蛋白表達變化的角度探討水飛薊賓對巨噬細胞源性泡沫細胞的影響，為水飛薊賓抗動脈粥樣硬化作用機制的研究和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料RAW264.7巨噬細胞由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院提供；油紅O、甘油明膠、水飛薊賓購自Sigma公司；SR-A、CD36、c-Jun、c-fos、β-actin抗體購于美國Abcam公司；1640培養(yǎng)基、消化胰酶、胎牛血清購自Gibco公司；oxLDL購自廣州奕源生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，胰酶消化傳代。培養(yǎng)液中加入水飛薊賓（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）干預(yù)24 h，加入20μLMTT孵育4 h后，加入DMSO 120μL震蕩10min，在波長570 nm處檢測吸光度A570。

1.2.2油紅O染色將RAW264.7巨噬細胞接種于6孔板內(nèi)，細胞孵育24 h結(jié)束后，吸棄上清液，10%多聚甲醛固定30min，PBS輕輕洗1次后，油紅O染色10min，再用60%異丙醇洗細胞1次（孵育時間10 s），吸棄異丙醇，PBS清洗1次后顯微鏡下照相。

1.2.3Western blotting檢測相關(guān)蛋白的表達經(jīng)過水飛薊賓（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）處理24 h，或c-Jun N端激酶抑制劑SP600125（10μm）孵育1 h后，再用25.0 ug/mL水飛薊賓孵育24 h，收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞并提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。25μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合后煮沸10min，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V，恒壓2 h），濕轉(zhuǎn)（300mA，恒流1.5 h），5%脫脂奶粉封膜1 h，PBST漂洗3次后分別加入一抗和β-actin 4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，37℃二抗（1∶1 000稀釋）反應(yīng)1 h后進行ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的表達情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用雙尾t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1水飛薊賓對RAW264.7巨噬細胞活性的影響不同濃度的水飛薊賓（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）孵育巨噬細胞24 h后，采用MTT法檢測細胞活性，A570值分別為3.70±0.03、3.69±0.05、3.68±0.07、3.68±0.06，水飛薊賓處理組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1，12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓對RAW264.7細胞活性無影響。

2.2水飛薊賓對巨噬細胞源性的泡沫細胞形成的影響

由圖2可知，對照組細胞內(nèi)聚集的脂質(zhì)較少，oxLDL處理組細胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，油紅O染色后陽性細胞數(shù)增加了（3.00±0.05）倍，與oxLDL組比較，水飛薊賓處理組（50μg/mL）細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集顯著減少，油紅O染色后陽性細胞數(shù)減少了（80.00±1.80）%。結(jié)果表明水飛薊賓可以抑制巨噬細胞對oxLDL攝取，從而減少泡沫細胞的形成。

圖1　水飛薊賓對巨噬細胞活性的影響

圖2　水飛薊賓對巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響（油紅O染色，400×）

2.3水飛薊賓對巨噬細胞膜蛋白SR-A、CD36蛋白表達的影響如圖3所示，水飛薊賓劑量依賴性降低巨噬細胞CD36蛋白的表達，12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓組CD36蛋白量是對照組的（0.60±0.06）、（0.45±0.07）、（0.10±0.06）倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓組SR-A蛋白量是對照組的（0.98±0.07）、（0.97±0.06）、（0.96±0.05）倍，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明水飛薊賓可能通過抑制CD36蛋白表達，從而抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取。

2.4水飛薊賓對細胞核c-Jun、c-fos蛋白表達的影響如圖4所示，水飛薊賓劑量依賴性降低細胞核c-fos蛋白量，12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓組細胞核c-fos蛋白量是對照組的（0.50±0.05）、（0.40±0.06）、（0.30±0.05）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；12.5、25.0、50.0μg/mL水飛薊賓組細胞核c-Jun蛋白表達量是對照組的（1.01± 0.06）、（1.00±0.08）、（0.99±0.05）倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3　水飛薊賓對巨噬細胞細胞膜蛋白CD36、SR-A蛋白表達的影響

2.5c-Jun N端激酶抑制劑SP600125對水飛薊賓減少巨噬細胞CD36蛋白表達的影響如圖5所示，c-Jun N端激酶抑制劑SP600125進一步增加水飛薊賓減少巨噬細胞CD36蛋白表達的作用。25.0μg/mL水飛薊賓處理細胞后，CD36蛋白量降低為對照組的（0.45±0.07）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SP600125與水飛薊賓共同孵育巨噬細胞后，CD36蛋白量降低為對照組的（0.20±0.06）倍，與水飛薊賓處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖4、5的實驗結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可能通過抑制c-fos/CD36通路減少巨噬細胞對oxLDL的攝取。

與對照組比較，aP＜0.05；與水飛薊賓處理組比較，bP＜0.05。

3　討論

有研究表明，水飛薊賓有降血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化的作用［10］。但水飛薊賓是否減少巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集及相關(guān)機制尚未見報道。本研究顯示，水飛薊賓通過減少巨噬細胞清道夫受體CD36的表達抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。本研究結(jié)果表明，水飛薊賓在動脈粥樣硬化區(qū)域維持泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)處于正常水平有保護作用，并闡明了相應(yīng)的機制。

清道夫受體介導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集在泡沫細胞形成過程中起著重要的作用［11］。本研究結(jié)果首次證明水飛薊賓通過減少巨噬細胞對oxLDL的攝取，從而抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。此外，水飛薊賓顯著降低巨噬細胞CD36蛋白的表達，但是對SR-A蛋白的表達無影響。清道夫受體CD36和SR-A是巨噬細胞攝取oxLDL的主要受體［3］。研究表明，從基因水平上滅活CD36后，在體外，巨噬細胞攝取的oxLDL減少，在體內(nèi)，ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊區(qū)域減少。且大量研究顯示，抗動脈粥樣硬化的抗氧化藥物能有效降低CD36的表達，表明CD36與動脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)［12-14］。本研究結(jié)果顯示，水飛薊賓通過抑制巨噬細胞CD36蛋白的表達，抑制巨噬細胞對oxLDL的攝取，且與水飛薊賓減少巨噬細胞細胞核c-fos蛋白量有關(guān)。事實上，c-Jun N端激酶抑制劑SP600125增加了水飛薊賓對CD36蛋白表達的抑制作用。本研究結(jié)果表明，水飛薊賓抑制泡沫細胞形成需要滅活c-fos通路。水飛薊賓具有減少CD36蛋白表達與減少巨噬細胞攝取oxLDL的功能，最終抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，水飛薊賓通過抑制巨噬細胞細胞核c-fos蛋白量，減少清道夫受體CD36蛋白的表達，從而減少巨噬細胞對oxLDL的攝取，最終抑制泡沫細胞的形成。本研究提供了水飛薊賓抗動脈粥樣硬化的新機制，同時也為抗動脈粥樣硬化提供了治療靶點。

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Effectsof Silibinin on uptake of oxLDL inmacrophages*

LiXiuying，Ye Yun△
（Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Southwest MedicalUniversity，Luzhou，Sichuan 646000，China）

·論著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.001

A

1009-5519（2016）08-1121-03

國家青年自然科學(xué)基金資助項目（81500357）；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院課題（15044）；西南醫(yī)科大學(xué)課題（2015-03-10）。

李秀英（1987-），博士研究生，講師，主要從事動脈粥樣硬化發(fā)病機制研究。

△，E-mail：yeyun8622@163.com。

（2016-02-21）