屠海燕，壽張飛（.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州3000；.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州3000）

妊娠期父源抗原特異性激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究

屠海燕1，壽張飛2
（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州321000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎臟內(nèi)科，浙江杭州321000）

目的探討妊娠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增與父源抗原的關(guān)系。方法建立正常妊娠（n=15）、流產(chǎn)傾向（n= 15）、第三方交配（n=15）及假孕（n=6）共四組小鼠模型，觀察調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平和激素含量變化。通過(guò)抗原特異性驗(yàn)證將父源抗原預(yù)免疫小鼠來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼滴注到孕鼠體內(nèi)，觀察其對(duì)胚鼠的保護(hù)作用。結(jié)果流產(chǎn)傾向組與正常妊娠組孕鼠體內(nèi)黃體酮、雌二醇、雌三醇水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。滴注父源抗原特異性激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或經(jīng)父源抗原預(yù)免疫的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后，孕鼠流產(chǎn)率下降，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平升高。結(jié)論妊娠期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增發(fā)揮保護(hù)作用的是父源抗原特異性激活，并非單一激素含量變化引起。

T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；激素類；抗原；流產(chǎn)，自然

正常妊娠是一種成功的半同種異體移植現(xiàn)象，孕婦對(duì)胚胎半同種異體抗原不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，反而產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象叫母胎免疫耐受，其具體機(jī)制一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。最近有研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不但參與了母胎免疫耐受機(jī)制的形成，而且對(duì)其維持具有重要作用［1］。2005年，Zenclussen等［2］提出，孕期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷將導(dǎo)致免疫性的自然流產(chǎn)，所以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在正常妊娠中發(fā)揮了極其重要的作用。此外，已有研究證實(shí)，妊娠期間調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)大量擴(kuò)增，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是以抗原特異性方式擴(kuò)增，并推測(cè)妊娠期激素水平變化是導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增的直接因素［2-4］。基于以上問(wèn)題，為了進(jìn)一步明確妊娠期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增原因，作者設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性CBA/J（H2K）小鼠51只、雄性DBA/2J（H2d）小鼠15只、雄性BALB/C（H2d）小鼠21只、雄性C57/BL6（H2b）小鼠15只均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。6～8周齡雌性小鼠和8～12周齡雄性鼠交配，每天檢查孕栓情況，一旦發(fā)現(xiàn)孕栓立即將雌雄鼠分開(kāi)，發(fā)現(xiàn)孕栓當(dāng)天記錄為孕0 d。

1.1.2試劑熒光素異硫氨酸標(biāo)記的抗鼠CD4抗體、葉綠素蛋白標(biāo)記的抗鼠CD3抗體、CY5標(biāo)記的抗鼠CD8抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠CD25抗體和抗鼠IgG2a同型抗體均購(gòu)自德國(guó)Becton Dickinson公司。藻紅蛋白標(biāo)記的抗鼠FOXP3抗體購(gòu)自德國(guó)E-Bioscience公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1流式細(xì)胞儀方法采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107mL-1。取2只試管，各加入100 μL細(xì)胞懸液。每管中加入熒光標(biāo)記抗鼠CD4抗體和抗CD25抗體各20 μL，然后4℃閉光孵育30 min。每個(gè)管中加入1 mL破膜緩沖液，于4℃閉光孵育30～60 min，使用2 mL的1×破膜緩沖液沖洗細(xì)胞，離心后棄上清液。一管中加入20 μL熒光標(biāo)記抗鼠FOXP3抗體，另一管中加入20 μL抗鼠IgG2a同型對(duì)照，然后4℃閉光孵育30～60 min，離心去上清液后放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。記錄胚胎著床的時(shí)間點(diǎn)，另將出現(xiàn)壞死、出血的時(shí)間點(diǎn)記錄為流產(chǎn)時(shí)間點(diǎn)，以流產(chǎn)點(diǎn)占所有著床點(diǎn)的百分比來(lái)計(jì)算流產(chǎn)率。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)老鼠血清黃體酮、雌三醇、雌二醇水平。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與設(shè)計(jì)

1.2.2.1實(shí)驗(yàn)分組（1）正常妊娠組：CBA/J小鼠與BALB/C交配各15只；（2）流產(chǎn)傾向組：CBA/J小鼠與DBA/2J小鼠交配各15只；（3）第三方組：CBA/J小鼠與C57/BL6小鼠交配各15只；（4）假孕組：CBA/J小鼠與輸精管結(jié)扎的BALB/C小鼠交配各6只。結(jié)扎輸精管的雄鼠精液不含有精子，但是含有父系抗原。

1.2.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）流產(chǎn)傾向組+靜脈滴注2×105個(gè)正常妊娠組（CBA/J×BALB/C交配）孕14 d來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，n=6；（2）流產(chǎn)傾向組+靜脈滴注2×105個(gè)第三方組（CBA/J×C57/BL6交配）孕14 d來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，n= 6；（3）流產(chǎn)傾向組+靜脈滴注2×105個(gè)流產(chǎn)傾向組（CBA/J× DBA/2J交配）孕14d來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，n=6；（4）流產(chǎn)傾向組+靜脈滴注2×105個(gè)下列方式取得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：未交配過(guò)的CBA/J雌性小鼠先腹膜內(nèi)注射1×107mL-1來(lái)自BALB/C雄性老鼠的脾臟細(xì)胞。上述處理后，雌鼠再和DBA/2J雄鼠交配。在孕14d，處死孕鼠，將分離得到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞用來(lái)靜脈注射。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用秩和檢驗(yàn)非參數(shù)分析法分析各組間的差異性，采用U檢驗(yàn)和Dunn′s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1流產(chǎn)傾向組、正常妊娠組孕鼠體內(nèi)黃體酮、雌二醇、雌三醇水平比較流產(chǎn)傾向組CBA/J×DBA/2J交配后黃體酮含量孕3.0 d時(shí)明顯上升，正常妊娠組CBA/J×BALB/C交配后孕3.0 d黃體酮水平升高。且在孕0.5、6.0、10.0d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，流產(chǎn)傾向組、正常妊娠組孕鼠體內(nèi)黃體酮水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。CBA/J× DBA/2J交配組、CBA/J×BALB/C交配組孕鼠在孕6.0 d時(shí)（孕6.0 d正好是流產(chǎn)發(fā)生時(shí)間）體內(nèi)雌三醇、雌二醇水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。但是CBA/J×DBA/2J交配后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量并不擴(kuò)增，見(jiàn)圖3。

圖1　流產(chǎn)傾向組、正常妊娠組孕鼠體內(nèi)黃體酮水平各時(shí)間點(diǎn)變化

圖2　流產(chǎn)傾向組、正常妊娠組孕鼠體內(nèi)雌激素水平各時(shí)間點(diǎn)變化

圖3　外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平

2.2父系抗原特異性激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增發(fā)揮保護(hù)性作用將來(lái)源于非孕雌鼠的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向組雌鼠后，仍發(fā)生流產(chǎn)。正常妊娠組孕鼠（CBA/J×BALB/C-H2d交配）來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向雌鼠后，流產(chǎn)率為1%，具有保護(hù)作用（圖4）。第三方組合CBA/J×C57/BL6-H2b交配后CBA/J孕鼠產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向組，結(jié)果顯示，第三方組來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不保護(hù)帶有H2K-H2d基因的胎鼠免受母鼠的排斥，流產(chǎn)率為13%（圖4）。同樣，過(guò)繼靜脈滴注CBA/J×DBA/2J-H2d交配組來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，不能保護(hù)CBA/J×DBA/2J-H2d組胚鼠免于流產(chǎn)，流產(chǎn)率為8%。

與此相反，若CBA/J雌鼠在交配前，用BALB/C品系的雄性老鼠脾細(xì)胞抗原預(yù)先注射免疫，其流產(chǎn)率明顯下降，流產(chǎn)率為3%（圖4）。同時(shí)，預(yù)先免疫注射父源脾臟細(xì)胞使孕鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加（圖3）。經(jīng)過(guò)BALB/C品系雄性小鼠脾細(xì)胞抗原預(yù)先免疫靜脈滴注后的CBA/J雌鼠，與帶有H2d基因的DBA/2J小鼠交配后，此孕鼠來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向組后，可保護(hù)胎兒免受排斥，達(dá)到正常懷孕，流產(chǎn)率為0（圖4）。推測(cè)因?yàn)殪o脈滴注BALB/C脾細(xì)胞后產(chǎn)生了H2d特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

為進(jìn)一步證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是父源抗原特異性激活的假說(shuō)，觀察到假孕組CBA/J小鼠與輸精管結(jié)扎的BALB/C小鼠交配后體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平升高。外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平和正常交配孕鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平相當(dāng)（正常妊娠組小鼠交配后的孕6.0 d），見(jiàn)圖3。

圖4　各組流產(chǎn)率散點(diǎn)圖

3　討　論

在正常妊娠中，胎兒的一半基因源于父親，其編碼的主要組織相容性抗原對(duì)母親來(lái)說(shuō)是一種同種異源基因抗原，理應(yīng)認(rèn)為被母體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并加以排斥，但眾所周知排斥反應(yīng)在整個(gè)妊娠反應(yīng)過(guò)程中并未發(fā)生。這必然存在母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的“半同種移植物”產(chǎn)生耐受，即母胎耐受。有研究證明，妊娠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在母胎耐受中發(fā)揮重要作用［5-6］。盡管孕期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量擴(kuò)增早有資料記載，Aluvihare等［3］研究發(fā)現(xiàn)，與未妊娠小鼠比較，無(wú)論是同種或異種交配的正常妊娠雌鼠，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞幾乎在所有免疫器官中均明顯擴(kuò)增。但是不能確定增加的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是因孕期體內(nèi)激素水平的變化［7］，還是針對(duì)父源性抗原而存在，或是上述2種機(jī)制共同參與的結(jié)果。

本研究采用流產(chǎn)免疫學(xué)途徑的最佳組合：雌性CBA/ J×雄性DBA/2J小鼠交配，原理是CBA/J品系的小鼠（帶有H2K基因）和DBA/2J（帶有H2d基因）的小鼠交配，流產(chǎn)率很高，而CBA/J品系的小鼠（帶有H2K基因）與同樣帶有H2d基因的BALB/C小鼠交配時(shí)，并不會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)。

首先，將來(lái)源于非孕雌鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給有流產(chǎn)傾向的孕鼠后，仍發(fā)生流產(chǎn)，說(shuō)明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞未起保護(hù)作用。作者將正常妊娠孕鼠（CBA/J× BALB/C交配）來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向孕鼠后，未發(fā)生流產(chǎn)，說(shuō)明其對(duì)胎鼠起保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)胎鼠的保護(hù)作用與妊娠有關(guān)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的保護(hù)作用是否與妊娠中體內(nèi)激素水平變化相關(guān)，對(duì)于激素水平的研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正常孕鼠（CBA/J×BALB/C交配）和流產(chǎn)傾向小鼠（CBA/J×DBA/2J交配）分別在懷孕第0.5、3.0、6.0、10.0天處死，檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)激素水平。結(jié)果顯示，自發(fā)性流產(chǎn)傾向小鼠和正常孕鼠一樣，黃體酮均在孕3.0 d開(kāi)始上升，但調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量并沒(méi)有擴(kuò)增。同時(shí)孕鼠在孕6.0d（孕6.0d正好是CBA/J×DBA/2J交配后孕鼠流產(chǎn)發(fā)生時(shí)間）體內(nèi)雌三醇和雌二醇水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增并不是由孕激素或雌激素水平的升高所引起。由此推測(cè)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)胚鼠的保護(hù)作用與父系抗原特異性刺激相關(guān)。

正常妊娠孕鼠（CBA/J×BALB/C交配）來(lái)源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞過(guò)繼靜脈滴注給流產(chǎn)傾向雌鼠后，流產(chǎn)率為1%，具有保護(hù)作用。而轉(zhuǎn)輸?shù)谌浇M（CBA/J×C57/BL6交配）孕鼠來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不具有保護(hù)作用，流產(chǎn)率為13%。作者分析因?yàn)閹в蠬2d基因的DBA/2J和帶有H2d基因的BALB/C小鼠具有相同的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子抗原，卻不同于帶有H2d基因的C57/BL6小鼠MHC分子抗原。正常孕鼠針對(duì)帶有H2d基因的BALA/C老鼠抗原產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以特異性地保護(hù)母體抗帶有H2d基因的DBA/2J小鼠反應(yīng)，而第三方組（CBA/J×C57/BL6-H2b）獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，不保護(hù)帶有H2k×H2d基因的胎鼠。表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有保護(hù)性作用必須由父系MHC復(fù)合體抗原激活。這為抗原啟動(dòng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

為進(jìn)一步證明該假說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)觀察了CBA/J品系雌鼠與輸精管結(jié)扎的BALB/C老鼠交配，結(jié)扎輸精管雄鼠的精液不含有精子，但含有父系抗原，該抗原確保了雌雄交配后雌鼠會(huì)針對(duì)該抗原進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。本研究觀察到父系抗原在交配后第5天暴露，形成假孕。事實(shí)上，因?yàn)楦冈纯乖?qū)使作用產(chǎn)生了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)張池，觀察到雌性鼠和輸精管被結(jié)扎雄鼠交配后的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯升高，并且和正常交配的孕鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平相當(dāng)。

最后，作者觀察到正常孕小鼠產(chǎn)后7 d，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到未孕基礎(chǔ)水平（圖3），這意味著一旦抗原消失（孕鼠出生后），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在數(shù)量上即減少，保護(hù)作用同時(shí)消失，這也很好地解釋了為什么在妊娠后母體會(huì)排斥來(lái)源于父源的移植物。

綜上所述，妊娠期間調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增不是激素事件驅(qū)動(dòng)引起，而是針對(duì)父系抗原產(chǎn)生，這部分地解釋了母胎耐受現(xiàn)象的相關(guān)機(jī)制，為今后相關(guān)研究提供了一定理論依據(jù)。

［1］Somerset DA，Zheng Y，Kilby MD，et al.Normal human pregnancy is associatedwith an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+regulatory T-cell subset［J］.Immunology，2004，112（1）：38-43.

［2］Zenclussen AC，Gerlof K，Zenclussen ML，et al.Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion：adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+T regulatory cellsprevents fetal rejection in a murine abortion model［J］.Am J Pathol，2005，166（3）：811-822.

［3］Aluvihare VR，Kallikourdis M，Betz AG.Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus［J］.Nat Immunol，2004，5（3）：266-271.

［4］Heikkinen J，M?tt?nen M，Alanen A，et al.Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human decidua［J］.Clin Exp Immunol，2004，136 （2）：373-378.

［5］Saito S，Sasaki Y，Sakai M.CD4（+）CD25high regulatory T cells in human pregnancy［J］.J Reprod Immunol，2005，65（2）：111-120.

［6］ Sasaki Y，Sakai M，Miyazaki S，et al.Decidual and peripheral blood CD4+ CD25+regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases［J］.Mol Hum Reprod，2004，10（5）：347-353.

［7］Polanczyk MJ，Carson BD，Subramanian S，et al.Cutting edge：estrogen drives expansion of the CD4+CD25+regulatory T cell compartment［J］. J Immunol，2004，173（4）：2227-2230.

Study on role of paternal antigens-specific CD4+CD25+T regulatory cells during pregnancy

Tu Haiyan1，Shou Zhangfei2（1.Department of Nephrology，Second Affiliated Hospital，Medical College，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 321000，China；2.Department of Nephrology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Medical College，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 321000，China）

ObjectiveTo investigate that the pregnancy induced T regulatory（Treg）cells are generated by aiming at paternal antigens or induced by in vivo hormone change.MethodsThe 4 mice model groups were set up：normal pregnancy（n=15），abortion trend（n=15），third party mating（n=15）and false pregnancy（n=6）.The change of Treg cells level and hormone content were observed.The Treg cells originated from paternal antigen premunity mice was adoptively instilled into the pregnant mice by the antigens-specific verification for observing its protective effect on embryonic mouse.ResultsThe in vivo progesterone，E2and E3levels had no statistical differences between the abortion trend group and the normal pregnancy group（P＞0.05）.After instilling Treg cells of paternal antigen specific activation or adoptive transfer paternal antigens-specific Treg cells，the abortion rate of pregnant mice was decreased，while Treg cells level was increased.ConclusionThe Treg cell amplification playing the protective role during pregnancy is paternal antigens specific activation，which is not caused by the single hormone content change.

T-lymphocytes，regulatory；Hormones；Antigens；Abortion，spontaneous

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.008

A

1009-5519（2016）04-0500-03

屠海燕（1985-），碩士研究生，主要從事腎臟疾病相關(guān)臨床研究工作。

（2015-08-16

2015-09-24）