王建飛，曹若瓊，孫陽陽，邱宇，王君，鐘理,3

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2保定市第一中心醫(yī)院；3 Western University of Health Science)

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糖尿病患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性變化及其影響因素分析

王建飛1，曹若瓊1，孫陽陽1，邱宇1，王君2，鐘理1,3

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2保定市第一中心醫(yī)院；3 Western University of Health Science)

目的觀察糖尿病患者白細(xì)胞端粒酶活性變化，并分析外周血白細(xì)胞端粒酶活性的影響因素。方法以1型糖尿病(T1DM)患者40例為A組，2型糖尿病(T2DM)患者80例為B組，健康體檢者50例為對(duì)照組。抽取各組外周靜脈血5 mL，離心后提取白細(xì)胞，采用熒光定量PCR法檢測各組白細(xì)胞中端粒酶活性。采用多元線性回歸分析法分析T2DM患者白細(xì)胞中端粒酶活性的影響因素。結(jié)果A、B、C組外周血白細(xì)胞端粒酶活性(Ct值)分別為31.64±1.03、32.22±0.75、33.19±0.95，組間兩兩比較，P均<0.05。性別、吸煙狀況與T2DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論糖尿病患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性升高，且T1DM患者白細(xì)胞端粒酶升高更明顯。性別、吸煙狀況是T2DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性的影響因素。

端粒酶；端粒酶活性；白細(xì)胞；糖尿??；1型糖尿??；2型糖尿病

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一段特殊DNA結(jié)構(gòu)，可保護(hù)染色體末端免于降解，維持細(xì)胞活性。端粒縮短常被臨床用作細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志[1]。端粒酶是一種核糖核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體，由具有逆轉(zhuǎn)錄活性的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、端粒酶RNA基因(TERC)、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TRF)三個(gè)亞基構(gòu)成[2]。既往研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者由于自身免疫作用或氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致外周血白細(xì)胞端粒存在非正常長度縮短現(xiàn)象，檢測糖尿病患者外周血白細(xì)胞的端粒酶活性可能成為糖尿病的重要分子指標(biāo)。2014年10月～2015年12月，本研究觀察了糖尿病患者的外周血端粒酶活性變化，并分析其影響因素?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2014年10月～2015年12月我院收治的120例糖尿病患者，其中男63例、女57例，年齡23～78歲；均符合《內(nèi)科學(xué)(第7版)》提出的T1DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；無大血管、腎臟病變等并發(fā)癥。120例糖尿病患者分為T1DM患者40例(A組)和T2DM患者80例(B組)。B組中男43例、女37例，年齡(55.71±10.61)歲，BMI(27.21±2.94)kg/m2，患病時(shí)間(7.39±7.12)年，其中吸煙24例、不吸煙56例；A組中男20例、女20例，年齡(43.50±13.19)歲，BMI(25.26±7.40)kg/m2，患病時(shí)間(6.33±4.85)年，其中吸煙13例、不吸煙27例。對(duì)照組為同期50例健康成年人，其中男23例、女27例，年齡23～78(46.11±15.85)歲，BMI(25.16±3.40)kg/m2，其中吸煙16例、不吸煙34例。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，三組均知情同意并簽署知情同意書。

1.2各組外周血白細(xì)胞端粒酶活性檢測①外周血白細(xì)胞獲?。撼槿「鹘M靜脈血5 mL，2 500 r/min離心30 min，提取分層中的白細(xì)胞，將提取白細(xì)胞用PBS 清洗兩遍，在顯微鏡下利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算單位體積白細(xì)胞數(shù)。取1×106個(gè)細(xì)胞，加入200 μL Lysis buffer(凱基生物公司，中國南京)，震蕩混勻，冰浴30 min。4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取上清，液氮急速冷凍后-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＂诎准?xì)胞中端粒酶活性檢測：采用熒光定量PCR法檢測各組外周血白細(xì)胞與血漿中的端粒酶活性[6,7]，所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。端粒酶相關(guān)引物 ACX：5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′ ；TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系(20 μL)：2x SYBR q-PCR Master Mix 10 μL、上游引物TS 1 μL、下游引物ACX 0.5 μL、端粒酶樣品5 μL、RNase free water 3.5 μL。反應(yīng)條件：25 ℃孵育30 min，95 ℃滅活端粒酶5 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s；熔解曲線設(shè)定為65 ℃、95 ℃。采用CFX96 熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)觀察各組白細(xì)胞與血漿中Ct值。以Ct值表示端粒酶活性強(qiáng)弱，Ct值大說明端粒酶活性低；Ct值小說明端粒酶活性高。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1各組白細(xì)胞中端粒酶活性A、B、C組外周血白細(xì)胞端粒酶活性分別為31.64±1.03、32.22±0.75、33.19±0.95，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2T1DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性影響因素在三組樣本的基本資料對(duì)比中，年齡與BMI差異性顯著(P均<0.05)；性別、患病時(shí)間與吸煙情況沒有顯著性差異(P均>0.05)。 糖尿病多元線性回歸分析顯示，A組性別、年齡、BMI、患病時(shí)間與吸煙情況與外周血白細(xì)胞的端粒酶活性均無關(guān)(P均>0.05)，見表1。B組年齡、BMI、患病時(shí)間與外周血白細(xì)胞端粒酶活性均無關(guān)(P均>0.05)；B組性別與吸煙情況與端粒酶活性呈負(fù)相關(guān)(β=-1.022、-0.714；P均<0.05)，見表2。

表1　T1DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果

表2　T2DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性影響因素的多元線性回歸分析結(jié)果

3　討論

超過90%人類腫瘤組織中均能發(fā)現(xiàn)端粒酶活性，而且活性異常，是比較廣譜的腫瘤標(biāo)志物之一，但在大多數(shù)正常組織和細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)端粒酶活性[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞中也存在端粒酶活性[10]，而且在很多疾病中也發(fā)現(xiàn)了外周血白細(xì)胞的端粒酶活性異?，F(xiàn)象，例如白血病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[11]等。許多疾病的體液中也能檢測出端粒酶活性，例如膀胱癌患者的尿液中[12]、肺癌患者的支氣管洗液等；并且惡性腫瘤患者的血漿中通?？梢詸z測出端粒酶活性，是由于腫瘤細(xì)胞破裂所致，而血漿端粒酶活性也成為惡性腫瘤檢測的重要標(biāo)志物之一。端粒酶活性與端粒長度是密切相關(guān)的，二者共同作用與人類身體健康與衰老密切相關(guān)。

外周血白細(xì)胞端粒酶活性檢測的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，T1DM患者的端粒酶活性要強(qiáng)于T2DM患者，并且二者的白細(xì)胞端粒酶活性都強(qiáng)于健康志愿者[15]。表明糖尿病與外周血白細(xì)胞的端粒酶活性密切相關(guān)，一些研究也發(fā)現(xiàn)在缺乏端粒酶的成年小鼠中，會(huì)出現(xiàn)血糖耐受量異常的現(xiàn)象。糖尿病患者端粒酶活性異常的作用機(jī)制的說法有：氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的反應(yīng)性氧族會(huì)對(duì)DNA造成嚴(yán)重?fù)p害，并主要破壞線粒體DNA而產(chǎn)生更多的氧族，從而破壞細(xì)胞功能導(dǎo)致端粒酶活性異常；或者糖尿病影響并提高患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性是為抑制高血糖所致的細(xì)胞凋亡[6]。而且T1DM對(duì)端粒酶活性的影響更大，T1DM是一種建立在遺傳基礎(chǔ)之上并與T細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的自身免疫性疾病，自身T淋巴細(xì)胞對(duì)胰島素多種抗原成分出現(xiàn)免疫不耐受，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞會(huì)攻擊胰島β細(xì)胞使其大量凋亡最終導(dǎo)致糖尿病的出現(xiàn)，并且與胰島細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的淋巴細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)異常凋亡現(xiàn)象[13]。T1DM外周血免疫細(xì)胞的異常凋亡與端粒長度的減短可能導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的端粒酶活性的異常。T2DM與T1DM的發(fā)病機(jī)制完全不同，T2DM是由于胰島素缺乏或者胰島素抵抗而產(chǎn)生的一種代謝性疾病，而長期的代謝紊亂可以導(dǎo)致端粒酶活性的異常，胰島素抵抗也會(huì)增加氧化應(yīng)激程度導(dǎo)致端粒酶活性的異常出現(xiàn)[14]。推測其原因可能是由于T1DM對(duì)人體細(xì)胞的破壞程度更大，氧化應(yīng)激反應(yīng)與自身免疫反應(yīng)將會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的端粒酶活性，因此，T1DM患者的端粒酶活性高于T2DM患者；以后還要加大試驗(yàn)量并積極探究影響糖尿病患者端粒酶異常機(jī)制。

在T2DM 患者中男性與吸煙患者的外周血白細(xì)胞端粒酶活性高于女性與不吸煙者，這可能與男性的不良生活習(xí)慣有關(guān)，吸煙、喝酒、熬夜、高脂肪攝入等不良的生活習(xí)慣會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的代謝紊亂繼而影響端粒酶活性；隨著年齡的增長，細(xì)胞老化、端粒長度減短而細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡過程，一般不會(huì)引起端粒酶的變化，肥胖是導(dǎo)致糖尿病產(chǎn)生的主要原因，而肥胖也會(huì)加重氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度，BMI的增加會(huì)加重糖尿病的病情，對(duì)于此次試驗(yàn)的結(jié)果在今后的研究中應(yīng)加大BMI的選擇范圍與樣本量，探究BMI是否對(duì)細(xì)胞端粒酶活性有影響。

綜上所述，糖尿病患者存在外周血白細(xì)胞端粒酶活性升高，且T1DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶升高更明顯。糖尿病患者外周血血漿中未見端粒酶活性。性別、吸煙狀況是T2DM患者外周血白細(xì)胞端粒酶活性的影響因素。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472744,81272444)。

鐘理(E-mail：lee_z@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.030

R587.1;R363.2

B

1002-266X(2016)27-0085-03

2016-01-28)