李　飛　李德新　周廣朋

(四川省人民醫(yī)院城東病區(qū) 肝膽胰外科，成都610101)

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miR-634在肝癌中的表達及對肝癌細胞生物學行為的影響

李飛李德新周廣朋①

(四川省人民醫(yī)院城東病區(qū) 肝膽胰外科，成都610101)

①四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)內(nèi)分泌科，成都610101。

目的：檢測microRNA-634(miR-634)在肝癌中的表達水平及其對肝癌細胞常見生物學行為的調(diào)控作用。方法：采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、Bel7402、Bel7404、SNU739)、69例肝癌組織及匹配癌旁組織中miR-634的相對定量，分析miR-634表達與肝癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、Child-Pugh分級、BCLC分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時構(gòu)建miR-634的真核表達載體并轉(zhuǎn)染肝癌細胞系，采用活細胞計數(shù)試劑盒CCK-8、流式細胞儀Annexin V/PI雙染法和Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-634對細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。結(jié)果：與正常人肝細胞系L-02相比，肝癌細胞的miR-634水平均降低(P<0.05)，表達量依次為HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721；69例肝癌組織的miR-634水平為(0.253±0.019)，低于匹配癌旁組織(P<0.05)，且與腫瘤直徑、分化程度、BCLC分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)。過表達組轉(zhuǎn)染24～96 h后的miR-634水平持續(xù)升高，與對照組和空轉(zhuǎn)染組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組和空轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組的增殖抑制率、凋亡率均升高，但穿膜細胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：miR-634在肝癌組織和細胞中均為低表達，且與臨床病理參數(shù)有關(guān)，上調(diào)其水平可抑制肝癌細胞增殖及侵襲并誘導凋亡，對于肝癌防治有重要借鑒價值。

肝癌；miR-634；增殖；侵襲；凋亡

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高且進展迅速，大多患者確診時已屬晚期，復發(fā)轉(zhuǎn)移是肝癌治療失敗的主要原因[1,2]。盡管癌癥的主要危險因素已闡明，但惡性腫瘤的發(fā)生機制目前仍不明確。微核糖核酸(miRNA)是一類進化上高度保守的內(nèi)源性RNA，可通過抑制或降解靶基因mRNA，從而達到抑制靶基因的作用，近年來發(fā)現(xiàn)miRNA對于癌癥的發(fā)生發(fā)展意義重大[2-5]。目前已證實miR-634為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，在誘導腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[6,7]，此外，miR-634具有化療增敏效果[8]。以上結(jié)果提示miR-634可作為惡性腫瘤防治的新靶點，但目前在肝癌中的功能尚不清楚。本研究擬在肝癌組織和細胞中觀察miR-634的表達并探討其與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，同時在肝癌細胞中進一步驗證其功能，探討miR-634在肝癌防治中的價值。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株、試劑及儀器人肝癌細胞系(HepG2、SMMC7721、Bel7402、Bel7404、SNU739)及正常人肝細胞系L-02細胞均購自中科院上海生化細胞所細胞庫，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Trizol總RNA抽提試劑購自美國Invitrogen公司，Brilliant? SYBR? Green QPCR Master Mix購自美國Stratagene公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自PROMEGA公司，過表達miR-634的真核表達載體pCDNA3.1(+)-miR-634由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司構(gòu)建。CO2細胞培養(yǎng)箱購自英國Forma Scientific公司，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀購自美國BD公司，全自動ABI 7300熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.1.2組織樣本收集本院病理科2013年5月至2015年3月存檔的石蠟包埋肝癌組織及匹配癌旁組織共69例，其中男性46例，女性23例；年齡范圍24～76歲，中位年齡為56.5歲，≤50歲者25例，>50歲者44例；腫瘤直徑：≤5 cm者28例，>5 cm者41例；分化程度：低、未分化36例，中、高分化33例；Child-Pugh分級：A級41例，B級28例；BCLC分期：B期30例，C期39例；37例有門靜脈癌栓；41例有肝外轉(zhuǎn)移。肝癌組織均由兩位病理學醫(yī)師共同診斷，且取樣前未行放化療。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)采用研磨機在液氮條件下磨碎組織，嚴格按照試劑說明書進行總RNA提取，經(jīng)分光光度計檢測后將OD260/OD280≈1.80～2.00的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，qPCR使用rilliant? SYBR?Green QPCR Master Mix在ABI 7300熒光定量PCR儀系統(tǒng)上完成。miR-634引物由Premier Primer 5.0 software設(shè)計(以U6 RNA為內(nèi)參)，miR-634上游引物：5′-CCUUCAAUUUGACCGUCCU -3′， 下游引物：5′-AAUAAAACCAGGUCGAAUAGGU-3′； U6 RNA上游引物：5′- CTCGC-TTCGGCAGCACA -3′ ，下游引物：5′- AACGCTTC-ACGAATTTGCGT -3′ 。反應條件為： 95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。實驗重復3次。應用2-△△Ct法測定miR-634基因的相對表達量，結(jié)果表示為：△△Ct=(CtmiR-634-CtU6)腫瘤組織-(CtmiR-634-CtU6)癌旁組織。采用qPCR檢測肝癌細胞相對于正常人肝細胞系L-02細胞的miR-634表達量，同時篩選miR-634水平最低的肝癌細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞分組及轉(zhuǎn)染根據(jù)RT-qPCR結(jié)果將miR-634表達量最低的肝癌細胞分為3組，分別為過表達組，轉(zhuǎn)染真核表達載體pCDNA3.1(+)-miR-634的肝癌細胞；空轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1(+)的肝癌細胞；對照組，不行任何干預措施。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后采取RT-qPCR檢測miR-634水平以驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3CCK-8法將各組細胞接種于96孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時每孔加入10 μl CCK-8溶液，于450 nm波長下測定各孔吸光度(A)。根據(jù)公式計算：增殖抑制率(%)=(1-空轉(zhuǎn)染組或過表達組A值/對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞儀PI/Annexin V雙染法按1×105個/ml的密度將3組細胞接種培養(yǎng)液中，分別于轉(zhuǎn)染48、96 h收集各組細胞，依次經(jīng)冷乙醇固定過夜、RNase A孵育后，加入10 μl Annexin V/FITC和0.3 μg PI染色，避光靜置15 min后，使用FACS Calibur流式細胞儀檢測凋亡情況，計算細胞凋亡百分率。實驗重復3次。

1.2.5Transwell侵襲實驗 將包被有Matrigel的Transwell 小室置于24孔培養(yǎng)板中，于小室外按照1∶1比例混合的條件培養(yǎng)液(400 μl)，取100 μl胰酶消化各組細胞(密度為1×109細胞/L)，常規(guī)孵育24、48 h后，取膜采用棉簽擦掉基質(zhì)膠和未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定后進行結(jié)晶紫染色，100 倍光鏡下每個濾膜隨機挑取8個視野計數(shù)穿膜的細胞。實驗重復3次。

2　結(jié)果

2.1miR-634在肝癌細胞系及肝癌組織中的相對定量圖1A顯示，與正常人肝細胞系L-02相比，肝癌細胞的miR-634水平均降低(P<0.05)，且表達量依次為HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721，鑒于SMMC7721的miR-634水平最低，故選此細胞株用于研究miR-634對肝癌細胞生物學行為的調(diào)控作用；圖1B顯示與癌旁組織相比，69例肝癌組織的miR-634水平降低至(0.253±0.019)，低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2miR-634水平與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系肝癌組織中，miR-634水平與性別、年齡及Child-Pugh分級均無關(guān)，但與腫瘤直徑、分化程度、BCLC分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)，其中腫瘤直徑>5 cm，分化程度為低、未分化，BCLC分期為C期，有門靜脈癌栓及有肝外轉(zhuǎn)移者的miR-634水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3過表達miR-634對SMMC7721細胞增殖的影響圖2A顯示，過表達組轉(zhuǎn)染24～96 h后的miR-634水平持續(xù)升高，與對照組和空轉(zhuǎn)染組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；圖2B顯示，過表達組轉(zhuǎn)染后的增殖能力受抑制，與其余兩組相比，轉(zhuǎn)染24～96 h后的增殖抑制率均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4過表達miR-634對SMMC7721細胞凋亡率的影響流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-634會誘導SMMC7721細胞凋亡，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后的凋亡率均低于其余兩組，轉(zhuǎn)染24 h的凋亡率分別為對照組和空轉(zhuǎn)染組的2.64和2.42倍，轉(zhuǎn)染48 h的分別為對照組和空轉(zhuǎn)染組的3.54和2.78倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組和空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48 h凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

2.5過表達miR-634對SMMC7721細胞侵襲水平的影響 Transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-634會抑制SMMC7721細胞侵襲，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后的穿膜細胞數(shù)均低于其余兩組，轉(zhuǎn)染24 h的穿膜細胞數(shù)分別為對照組和空轉(zhuǎn)染組的0.63和0.64倍，轉(zhuǎn)染48 h的分別為對照組和空轉(zhuǎn)染組的0.57和0.53倍，差異均有無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組和空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48 h穿膜細胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖1　miR-634在肝癌細胞系及肝癌組織中的相對定量Fig.1　miR-634 in hepatocellular carcinoma cell line and relative quantitative in liver cancer tissueNote: A.Liver cancer cell lines;1.L-02;2.HepG 2;3.SMMC7721;4.Bel 7402;5.Bel 7404;6.SNU739;B.Cancer of liver tissue.

表1　肝癌組織中miR-634水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1　miR-634 levels in liver cancer tissue relationship with clinicopathological parameters

圖2　轉(zhuǎn)染對SMMC7721細胞miR-634水平及增殖抑制率的影響Fig.2　Transfection miR-634 levels on SMMC7721 cells and effect of proliferation inhibition rateNote: A.mrR-634 relative expression;B.Proliferation inhibition rate.

表2　兩組轉(zhuǎn)染后的凋亡率和穿膜細胞數(shù)比較Tab.2　Comparied with two groups after transfection of apoptosis rate and number of transmembrane cells

圖3　過表達miR-634對SMMC7721細胞凋亡和侵襲水平的影響Fig.3　Over expression of miR-634 of SMMC7721 cellNote: A.Cell opsptosis flow detection figure;B.Cells invade transwell detection figure.

3　討論

近年來，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為腫瘤防治熱點，多項研究提示其可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為，根據(jù)miRNA的作用效果分為癌基因或抑癌基因兩大類[9,10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，肝癌組織及外周血中的miRNA表達譜變化較大[5]，如Wen等[11]發(fā)現(xiàn)在與健康體檢者相比，肝癌患者血漿中的miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、miR-92a-3p、 miR-132-3p、miR-185-5p、miR-320a 和miR-324-3p為高表達，其建議可用異常表達的miRNA來輔助肝癌的診斷。此外，Sato等[12]發(fā)現(xiàn)異常表達的miRNA譜可用于預測肝癌術(shù)后切除的復發(fā)情況。以上結(jié)果表明從肝癌中異常表達的miRNA入手可能有助于闡明肝癌的發(fā)病機制，但目前miRNA異常表達對腫瘤惡性行為的影響仍處于初步階段。

miR-634為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，已證實在多種惡性腫瘤患者的組織和血漿中低表達，如張永海等[13]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，膀胱癌患者血漿miR-634水平下調(diào)，與正常水平相比降低了約61%。Peng等[8]發(fā)現(xiàn)miR-634參與了鼻咽癌細胞的紫杉醇耐藥，如鼻咽癌紫杉醇耐藥株CNE-1/Taxol中的miR-634水平高于親本CNE-1細胞。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中的miR-634水平低于正常人肝細胞系L-02，且肝癌組織中的miR-634水平亦低于匹配的癌旁組織，以上結(jié)果表明miR-634低表達可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。為探討miR-634在肝癌防治中的價值，本研究進一步探討miR-634表達與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-634水平與腫瘤直徑、分化程度、BCLC分期、門靜脈癌栓及肝外轉(zhuǎn)移均有關(guān)，且惡性程度越高則miR-634水平越低，表明miR-634水平可能參與了肝癌惡變、生長及侵襲轉(zhuǎn)移過程，在肝癌調(diào)控中亦發(fā)揮抑癌基因的作用。

多項研究表明miR-634參與了腫瘤細胞的惡性表型轉(zhuǎn)化，如Cong等[7]同樣發(fā)現(xiàn)miR-634可抑制宮頸癌細胞的增殖并誘導其凋亡，其推測可能與miR-634靶向抑制mTOR信號通路有關(guān)，Peng等[8]發(fā)現(xiàn)該miRNA可抑制鼻咽癌細胞的增殖。鑒于本研究檢測的5株肝癌細胞株中，SMMC7721的miR-634水平最低，故選取SMMC7721細胞用于驗證miR-634對肝癌增殖、凋亡及侵襲的影響。本研究在轉(zhuǎn)染后觀察miR-634水平變化發(fā)現(xiàn)，在24～96 h時間窗內(nèi)轉(zhuǎn)染組的miR-634水平逐漸升高，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)觀察。過表達miR-634可明顯抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，同時可誘導細胞凋亡，確定了miR-634在肝癌調(diào)控中發(fā)揮抑癌基因的作用，推測可能與miR-634可激活線粒體凋亡途徑來促進凋亡有關(guān)。此外， Fujiwara等[6]在鼻咽癌細胞株中發(fā)現(xiàn)miR-634表達可提高提高化療誘導的細胞毒性，對于化療增敏有一定價值，下一步本研究將驗證miR-634對肝癌細胞化療是都有增敏效果。以上結(jié)果表明miR-634在惡性腫瘤中發(fā)揮較廣的抑制作用，為惡性腫瘤的基因治療提供了有力依據(jù)。

綜上所述，肝癌細胞和肝癌組織中miR-634的表達水平均降低，且肝癌組織中miR-634水平與臨床病理參數(shù)有關(guān)，采用基因手段上調(diào)miR-634水平可抑制肝癌細胞增殖及侵襲并誘導凋亡，在肝癌防治中有較大潛能，對于肝癌防治有重要借鑒價值，但需在動物實驗中進一步驗證。

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[收稿2015-11-05修回2015-11-17]

(編輯許四平)

Expression of miR-634 in hepatocellular carcinoma and its effect on biological behavior of Hepatocellular carcinoma cells

LI Fei，LI De-Xin,ZHOU Guang-Peng.The East ward of Sichuan Provincial People′s Hospital of Hepatobiliary Surgery,Chengdu 610101，China

Objective:To detect the expression level of microRNA-634 (miR-634) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its regulatory effect on the common biological behavior of hepatocellular carcinoma cells. Methods: Real-time fluorescence quantitative PCR (RT qPCR) method was used to detect HCC cell lines (HepG2, SMMC7721, BEL7402, bel7404, SNU739), 69 cases of HCC tissues and matching relative quantification of miR-634 paracancerous tissues and analysis of relationship between miR-634 expression and HCC patients gender, age, tumor size, degree of differentiation, child Pugh classification, BCLC staging, portal vein tumor thrombus and liver metastasis, while building a miR-634 eukaryotic expression vector and transfected into hepatocellular carcinoma cell lines, using live cell counting kit-8 CCK-8, flow cytometric annexin V/PI double staining and Transwell experiment to detect the transfection miR-634 on cell proliferation, apoptosis and invasion effects.Results: Compared with the normal human liver cell line L-02 and hepatocellular carcinoma cells miR-634 were decreased (P<0.05), the expression followed by HepG2>SNU739>Bel7402>Bel7404>SMMC7721;69 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) of miR-634 level (0.253±0.019) and lower than that of the matched paracancerous tissues (P<0.05), and related with the tumor size, degree of differentiation, BCLC stage, portal vein tumor thrombus and liver metastasis (P<0.05). Over expression in the transfected group 24-96 h after miR-634 level continues to rise, control group and blank vector transfected group differences were statistically significant (P<0.05);and the control transfection group and blank group compared to transfection proliferation inhibition rate, apoptosis rate was increased, but wear the number of cell membrane decreased, the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: miR-634 in hepatocellular carcinoma tissues and cells were low expression and related to clinical pathological parameters, raised its level can inhibit the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells and induce apoptosis, for the prevention and treatment of liver cancer has an important reference value.

Hepatocellular carcinoma;miR-634;Proliferation;Invasion;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.017

R735.7文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1160-05

李飛(1972年-)，男，主治醫(yī)生，主要從事肝膽胰腺外科,E-mail:lllfff_14@sina.com。