卜小芳　王　健　倪　寧　田恒忠　祁慶松　孔占一

(安徽省淮南市婦幼保健院兒科，淮南 232007)

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肺炎支原體肺炎患兒外周血CXCL8及其mRNA表達①

卜小芳王?、谀邔幪锖阒移顟c松孔占一

(安徽省淮南市婦幼保健院兒科，淮南 232007)

①本文為安徽省自然科學基金(No.1308085MH148)、安徽省教育廳自然科學基金重點項目(No.KJ2010A086)、淮南市2015年科技計劃項目(No.2015A2406)和安徽省教育廳重大自然科學研究項目(No.KJ2016SD20)。

②安徽理工大學醫(yī)學院病原學與免疫學教研室，淮南232001。

目的：探討支原體肺炎患兒外周血CXCL8及其mRNA表達的臨床意義。方法：收集2013年10月～2015年3月淮南市婦幼保健院收治的支原體肺炎患兒48例，其中重癥12例，輕癥36例，以ELISA法檢測患兒血清CXCL8含量，PCR法檢測患兒外周血單個核細胞內CXCL8 mRNA水平。以GAPDH為參照，以lgcDNA/lgGAPDH比值代表其最終mRNA水平。結果：支原體肺炎患兒外周血血清CXCL8含量及外周血單個核細胞內CXCL8 mRNA水平分別為(298.917±51.860)pg/ml、(1.848±0.525)lgcDNA/lgGAPDH，與正常對照相比差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，重癥患兒外周血CXCL8及其mRNA進一步升高，與輕癥組相比，血清CXCL8含量差異無顯著統(tǒng)計學意義統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而CXCL8 mRNA水平差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。急性期以紅霉素靜脈注射7～10 d，使患兒病情得以明顯控制，咳嗽癥狀減輕，肺部炎癥逐漸改善，病情得到有效控制，再以阿奇霉素序貫治療2～3周，患兒病情逐步由急性期轉為恢復期，此時患兒外周血CXCL8及其mRNA水平明顯降低，與急性期相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：支原體肺炎患兒外周血CXCL8及其mRNA表達水平增高，并與病情的嚴重程度相關。CXCL8參與支原體肺炎的發(fā)病過程，并對病情的輕重程度和轉歸有一定的提示作用。阿奇霉素可通過抑制肺炎支原體增殖途徑降低患兒血清中CXCL8含量、下調CXCL8 mRNA的表達，逐漸抑制由肺炎支原體介導的免疫損傷。

肺炎支原體；支原體肺炎；外周血單個核細胞；CXCL8；mRNA

支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)亦稱原發(fā)性非典型性肺炎，是由肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)引起，并以支氣管和肺間質為主要病變的急性炎癥，嬰幼兒及兒童多見。近年來研究資料顯示嬰幼兒MP感染率達12.3%，且季度分布從1.5%至27.3%不等[1]。我國嬰幼兒MP感染水平亦呈上升趨勢[2]，且具有好發(fā)年齡提前、病程長、易反復等特點，其確切機制有待進一步闡明。目前研究表明，肺炎支原體不僅是病原體，也是重要的變應原，可激活機體免疫系統(tǒng)，誘導強烈的應答反應。細胞免疫在患兒肺間質性炎癥病理改變過程中發(fā)揮重要調節(jié)功能。CXCL8是CXC趨化因子亞家族中的重要成員，是關鍵的炎癥因子，在介導炎癥反應中起重要作用[3]。為探討CXCL8在支原體肺炎疾病轉歸中的作用，本文選擇典型的支原體肺炎患兒，檢測其外周血CXCL8及其mRNA，現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料48例支原體肺炎患兒系2013年10月～2015年3月本市婦幼保健院收治的病人，其中男28例，女20例，年齡4月～10歲，其中年齡3～12月者6例，1～3歲者18例，3～10歲者24例。臨床診斷依據(jù)兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)的診斷標準[4，5]。入選患兒血清抗-MP-IgM(+)，痰培養(yǎng)陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，無長期使用皮質激素使用史。依患兒病情分為輕癥36例、重癥12例兩組，依患兒病程分為急性期和恢復期。取同期門診體檢正常30例兒童為對照，男女各為15例，年齡5個月～15歲，無呼吸道及全身感染。

1.1.2試劑與儀器CXCL8酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(法國DIACLONE公司)；胎牛血清購自美國Bio Basic Inc(BBI)公司；Ficoll-Hypaque分離液(1.077±0.001)購自上海試劑二廠；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；RPMI1640完全培養(yǎng)液購自美國Sigma公司； TIANScript cDNA合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；LightCyder FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ(德國Roche公司)。EXL-50X全自動洗板機、EXL-808全自動酶標儀均購自美國Bio-Tek公司；5415D臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司；UV-5800PC紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；Nikon E-400熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；TaKaRa梯度PCR儀TP600(日本TaKaRa公司)；iCycle(R)熒光實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Hema-2000凝膠分析系統(tǒng)(珠海Hema公司)。

1.2方法

1.2.1標本采集采取患兒腹股溝靜脈血或外周肘靜脈血5 ml，分別置含肝素的無菌Eppendorf管和潔凈的Eppendorf管。肝素抗凝血以Ficoll-Hypaque常規(guī)分離PBMCs，提取總RNA和CXCL8 mRNA檢測；普通管常規(guī)分離血清檢測CXCL8。

1.2.2CXCL8檢測采用固相夾心ELISA法。以試劑盒所配標準品繪制標準曲線。每次檢測設空白及標準各2孔，復孔檢測。于450 nm處讀取吸光度值，每孔測定2次，取均值，根據(jù)樣品OD值從標準曲線確定樣品CXCL8含量。

1.2.3PBMCs總RNA提取及其濃度、純度鑒定參照王健等[6]方法提取PBMCs，并進一步提取總RNA，核酸凝膠圖像分析儀下可見清晰的28S、18S、5.8S三條帶，且28S條帶密度是18S條帶密度的2倍以上；分光光度計測OD260/OD280值為1.8～2.0，見圖1。

1.2.4CXCL8 mRNA檢測以隨機引物分別將所提取的總RNA逆轉錄為cDNA。根據(jù)GeneBank中人CXCL8基因序列，以Primer Express軟件設計特異性引物和探針，以磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceralde-hyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參，引物和探針序列見表1。所有引物和探針均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。檢測步驟參照王健等[6]步驟。為克服系統(tǒng)誤差，以GAPDH為內參照，

表1　MP、CXCL8、CXCR1、CXCR2、CD16、GAPDH引物和探針序列Tab.1　Primer sequences of MP,CXCL8,CXCR1,CXCR2,CD16,GAPDH

以lgcDNA/lgGAPDH比值代表其最終mRNA水平。

2　結果

2.1患兒CXCL8表達支原體肺炎患兒外周血CXCL8水平較正常對照組顯著升高，差異有顯著性(P<0.05)，以重癥患兒外周血CXCL8含量升高更顯著；對比觀察輕癥和重癥患兒外周血CXCL8水平，差異有顯著性(P>0.05)。但動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)患兒急性期CXCL8升高明顯，急性期與恢復期相比，差異有顯著性(P<0.05)。見圖2。

2.2患兒PBMCs內CXCL8 mRNA表達支原體肺炎患兒PBMCs內CXCL8 mRNA水平較正常對照組顯著上調，差異有顯著性(P<0.05)，進一步對比觀察，發(fā)現(xiàn)無論是輕癥和重癥患兒之間，還是急性期與恢復期相比，CXCL8 mRNA載量均有顯著增加，彼此相比差異有顯著性(P<0.05)。如圖3、圖4。凝膠灰度掃描示重癥患兒外周血CXCL8mRNA的掃描激發(fā)熒光條帶亮度增強，如圖4。

圖1　PBMCs總RNA電泳圖Fig.1　Electrophorogram of total RNA from PBMCs

圖2　支原體肺炎患兒外周血CXCL8表達水平Fig.2　Levels of CXCL8 in peripheral blood of Mycoplasma pneumoniae

2.3患兒胸部X線特征改變支原體肺炎患兒以輕癥病例為主，胸部X線呈現(xiàn)兩肺斑點狀和斑片狀模糊狀陰影，以右肺多見，如圖5A示；而重癥患兒胸片可見大片狀模糊陰影，以右肺大葉性肺炎多見，如圖5C示。予紅霉素、阿奇霉素序貫治療3～4周，患兒病情得以明顯控制，咳嗽癥狀緩解，肺部炎癥逐漸吸收，肺部斑點狀和斑片狀模糊陰影明顯吸收，病情逐步由急性期轉歸為恢復期，如圖5B、D。

圖3　支原體肺炎患兒外周血CXCL8及其mRNA表達Fig.3　Expression of CXCL8 mRNA in PBMCs of mycoplasmal pneumoniaNote: M.DL2000;1,2.GAPDHC and XCL8 of normal control;3-6.GAPDH and CXCL8 of mycoplasmal pneumonia(light 1 and light 2);7-10.GAPDH and CXCL8 of mycoplasmal pneumonia (severe 1 and sever 2).

圖4　支原體肺炎患兒PBMCs內CXCL8 mRNA表達水平Fig.4　Levels of CXCL8 mRNA in PBMCs of Mycopla-sma pneumoniae

圖5　支原體肺炎治療前后影像學特征Fig.5　Iconography features of Mycoplasma pneumoniae before and after treatmentNote: A and B.Before and after treatment of the patient (Light)；C and D.Before and after treatment of the patient (Severe).

3　討論

支原體肺炎以間質性炎性浸潤和急性毛細支氣管炎為主要病理改變。其以特殊頂端結構中的P1表面蛋白(170 kD)和P30(32 kD)為主要黏附素，黏附于宿主上皮細胞表面，定植于細胞間隙，導致宿主細胞損傷[7,8]。其毒性代謝產物如神經(jīng)毒素、磷脂酶C、過氧化氫等使宿主纖毛細胞運動減弱甚至脫落消失，繼發(fā)引起宿主黏膜上皮細胞損傷。浸潤性炎癥沿支氣管、肺血管周圍發(fā)展,達肺泡間隔,并累及肺泡,引起肺小葉、肺泡間隔的間質性浸潤[9]。

細胞免疫在其致病機制中起重要作用。當肺炎支原體感染，觸發(fā)機體免疫系統(tǒng)，產生多種趨化因子如CXCL8、TNF-α等[10]，參與局部和全身炎癥反應。適度的炎癥反應有利于清除致炎因子，對機體起保護作用，過度的炎癥反應可致免疫病理損傷，并不有利于病情恢復。CXCL8屬ELR+CXC趨化因子，來源于多種免疫細胞，如單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞和肝細胞等[11]，其趨化吸引多種炎癥細胞至肺部組織浸潤積聚,釋放血管活性物質,引起組織免疫損傷?，F(xiàn)有研究表明支原體肺炎時肺部的浸潤細胞主要是單核巨噬細胞、淋巴細胞及中性粒細胞[12]。

CXCL8是一種分子量約8～10 kD并具有高度活性的小分子多肽，是一種多源性來源的促炎反應細胞因子[13,14]。本文研究結果顯示，支原體肺炎患兒外周血CXCL8水平較正常對照組顯著升高，提示定植于氣管、支氣管上皮細胞的MP釋放毒性代謝產物，不僅可引起局部上皮細胞損傷，支氣管水腫、炎癥浸潤，還可沿支氣管、肺血管累及肺泡間隔和肺泡，引起肺小葉、肺泡間隔呈間質性炎癥。此外，肺炎支原體還可激活患兒的免疫系統(tǒng)，促使單核-巨噬細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞及上皮細胞大量分泌CXCL8，部分CXCL8釋放入血，使外周血中CXCL8水平升高，高水平的CXCL8有助于機體防御MP進一步侵入[15]，但過量的CXCL8可趨化吸引大量炎癥細胞于病灶處聚集浸潤，介導肺、氣管、支氣管上皮細胞產生免疫損傷，使患兒出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，重癥患兒外周血CXCL8水平進一步升高，與輕癥患兒相比，差異無顯著性，提示CXCL8雖然參與MP所致的免疫病理損害，但與免疫損傷的程度沒有明顯關系。重癥患兒外周血中CXCL8滴度較高，MP黏附局部上皮細胞使其分泌更多的CXCL8，它們彼此相互協(xié)調，共同趨化吸引單核-巨噬細胞、淋巴細胞至病灶處聚集，引起氣道平滑肌收縮，腺體分泌增加，氣道反應性增高，誘導強烈的炎癥反應和嚴重的組織損傷[16]。臨床上針對這類患兒在傳統(tǒng)應用大環(huán)內酯類抗生素基礎上，聯(lián)合應用糖皮質激素或/和靜注人免疫球蛋白，能抑制過強的免疫反應對組織造成的免疫損傷。

mRNA是反映細胞內基因轉錄翻譯的指標，可進一步了解某基因在特定條件下的調控能力。CXCL8 mRNA是調控轉譯CXCL8的敏感指標，能直接影響外周血CXCL8的表達水平[17,18]。肺炎支原體缺乏細胞壁，細胞膜中富含膽固醇，其特殊的末端結構(Terminal structure)能促使支原體于呼吸道黏膜上皮細胞表面黏附定植，引起細胞損傷，誘導免疫應答。PBMCs富含多種免疫細胞，在機體抗感染免疫過程中起關鍵作用。本文研究結果發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎患兒PBMCs內CXCL8 mRNA水平亦較正常對照組顯著升高，提示細胞免疫在由支原體介導的炎癥過程中起重要作用，并能在基因轉錄水平上調表達，趨化吸引大量單核-巨噬細胞、中性粒細胞，促進免疫細胞活化并分泌更多的CXCL8進入外周血[19]，形成局限性的炎性浸潤，促進吞噬和殺傷支原體。已知支原體肺炎以間質性肺炎和急性毛細支氣管炎為主，感染中毒癥狀輕，但本文發(fā)現(xiàn)少數(shù)重癥患兒表達高水平的CXCL8 mRNA，過度上調的CXCL8 mRNA并不有利于清除入侵的肺炎支原體，反而進一步激活炎性因子信號傳導通路，釋放更多炎性因子，使肺、支氣管等局部炎癥進一步加重[20]。

阿奇霉素是第二代大環(huán)內酯類抗生素,是在紅霉素結構的基礎上經(jīng)重排、擴環(huán)、還原和N-甲基化等分子重構而成，具有組織滲透性好的優(yōu)點[21]，巨噬細胞可通過跨膜轉運方式促使阿奇霉素在局部病灶細胞內維持較高水平,提高其治療效果。急性期以紅霉素靜脈注射7～10 d，使患兒病情得以明顯控制，咳嗽癥狀減輕，肺部炎癥逐漸改善，病情得到有效控制，再以阿奇霉素序貫治療2～3周， 病情逐步由急性期轉歸為恢復期，此時患兒外周血CXCL8及其mRNA均明顯降低，與急性期相比，差異有顯著性(P<0.05)。提示阿奇霉素不僅可抑制MP增殖，降低病原體的致炎作用，亦可抑制炎癥反應，減輕免疫損傷，并能下調CXCL8 mRNA表達，減少CXCL8的分泌，使免疫損傷逐漸恢復。但部分恢復期的病例與正常對照相比，外周血CXCL8或CXCL8 mRNA水平仍較高，對這些患兒即使臨床癥狀改善，還應繼續(xù)鞏固治療，預防病情復發(fā)。

胸部X線檢查對診斷患兒肺和氣道病變，評估疾病的嚴重程度及轉歸有重要意義[22]。本文研究發(fā)現(xiàn)支原體肺炎患兒以輕癥病例為主，胸部X線以右肺斑點狀和斑片狀模糊狀陰影多見，急性期患兒常呈現(xiàn)混合性通氣功能障礙，即既有限制性通氣功能障礙，又有阻塞性通氣功能障礙。有趣的是不同年齡組患兒胸部X線表現(xiàn)各異，3歲以下的嬰幼兒以斑片狀密度增高影病變多見，兩肺均可受累；年長患兒以肺段或肺葉實質性浸潤病變?yōu)橹鳎乙詥蝹葹橹?，尤以右下肺和右肺中葉病變多見，邊緣模糊，密度較低，此可能與右肺中葉支氣管較細長的解剖結構有關。隨著進一步治療，患兒癥狀改善，病情逐步進入恢復期，但部分患兒因氣道高反應性，肺順應性恢復相對較慢，持續(xù)時間較長，應特別加強對氣道炎癥針對性治療，增加呼吸訓練，促進間質性病變的恢復[23,24]。

綜上所述，支原體肺炎是兒童常見的呼吸道疾病，肺炎支原體作為支原體肺炎的病原體，亦是致炎的關鍵始動因素。CXCL8作為一種促炎因子，參與支原體肺炎的發(fā)病過程，并在炎癥浸潤免疫病理反應過程中起重要作用。支原體肺炎患兒外周血CXCL8及其mRNA表達水平增高，并與病情的嚴重程度具有一定的相關性，可作為監(jiān)控病情轉歸的實驗室輔助診斷指標。阿奇霉素可降低患兒血清中CXCL8含量、下調CXCL8 mRNA的表達，逐漸抑制由肺炎支原體介導的免疫損傷。

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[收稿2015-11-09修回2015-12-01]

(編輯倪鵬)

Expression of CXCL8 and its mRNA in peripheral blood of children with Mycoplasmal pneumonia

BU Xiao-Fang,WANG Jian,NI Ning,TIAN Heng-Zhong,QI Qing-Song,KONG Zhan-Yi.Department of Pediatrics,the Maternal and Child Health-Care Hospital of Huainan,Huainan 232007,China

Objective:To study the expression of CXCL8 in the serum and CXCL8 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of the children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP) and its clinical significance.Methods: Forty-eight children(severe cases 12,light cases 36) with MPP were recruited from October 2013 to March 2015 in the Maternal and Child Health-Care Hospital of Huainan.The concentration of the CXCL8 in serum and the level of CXCL8 mRNA in the PBMCs were measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and polymerase chain reaction(PCR).Taking GAPDH as the internal reference,the ratio of lgcDNA/lgGAPDH was regarded as the extreme level of CXCL8 mRNA.Results: The serum level of CXCL8 and expression of CXCL8 mRNA in PBMCs in the children with MPP were (298.917±51.860)pg/ml and (1.848±0.525)lgcDNA/lgGAPDH.Compared with the normal control,there were significant differences between the two groups(P<0.05).Further observation showed that the levels of CXCL8 in serum were no significant difference between in light cases and severe illness(P>0.05).However,the expression of CXCL8 mRNA in peripheral blood of the children with severe illness was significantly higher than those in light cases(P<0.05).Intravenous infusion of Erythromycin was provided in the acute phase for seven to ten days,so that the children′s condition could be significantly controlled,and the symptoms of pulmonary inflammation were also relieved.Followed by the use of sequential therapy of Azithromycin for about two to three weeks,the children′s condition were gradually from acute stage to recovery stage.At this time,the CXCL8 and its mRNA levels in peripheral blood of the sick children were all significantly decreased comparing with those in the acute stage(P<0.05).Conclusion: The expression of CXCL8 and its mRNA were increased in the peripheral blood of the sick children with Mycoplasma pneumonia,and also correlated with the severity of the disease.CXCL8 can participate in the pathogenesis of Mycoplasma pneumonia,and has a certain cue effect on the severity and prognosis of the disease.Azithromycin can reduce the content of CXCL8 in serum of the sick children via the pathway of inhibiting the proliferation of Mycoplasma pneumoniae,and down regulate the expression of mRNA,so that the immune injury mediated by Mycoplasma pneumoniae may be gradually inhibited.

Mycoplasma pneumoniae(MP);Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP);Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs);CXCL8;mRNA

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.025

R375+.2R392.11文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1195-05

卜小芳(1967年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事兒科呼吸道感染與免疫臨床研究，E-mail:13956456688@126.com。

及指導教師：王健(1962年-)，男，教授，碩士生導師，主要從事病原感染與免疫研究，E-mail:wangjian8237@sina.com。