程桂雪　李永哲　秦曉松

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院檢驗科，沈陽110004)

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特發(fā)性膜性腎病相關自身抗體研究進展

程桂雪李永哲秦曉松

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院檢驗科，沈陽110004)

膜性腎病是成人腎病綜合征最常見的病理表現(xiàn)之一，為我國原發(fā)性腎小球疾病的第二大病因。大約70%的膜性腎病患者表現(xiàn)為持續(xù)反復的蛋白尿，可致腎臟損傷，危及生命。約1/3膜性腎病患者可以自發(fā)緩解、逐漸好轉，還有約1/3的患者在5～10年后發(fā)展為終末期腎病，其余患者則表現(xiàn)為持續(xù)蛋白尿[1,2]。膜性腎病可分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩類，其中特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)占70%～80%，主要指沒有明確病因引起的腎小球基底膜改變，其治療主要應用激素、免疫抑制劑，如環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松等[3,4]；繼發(fā)性膜性腎病(Secondary membranous nephropathy,SMN) 占20%～30%，一般繼發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)等自身免疫疾病，感染(乙型/丙型肝炎病毒感染)，惡性腫瘤和藥物中毒等。IMN的發(fā)病機理、病因尚不明確，目前缺乏診斷的特異性實驗室指標?，F(xiàn)就目前發(fā)現(xiàn)的IMN相關靶抗原及其作用機制綜述如下(表1)。

1　特發(fā)性膜性腎病的相關足細胞靶抗原及其作用機制

1.1小鼠Heymann腎炎的靶抗原1959 年Heymann等[5]用大白鼠腎勻漿和佐劑反復免疫健康同種大白鼠,制作出類似人類MN(Membranous Nephropathy,MN) 模型，稱為Heymann腎炎(Heymann nephropathy,HN)。免疫熒光顯示IgG、C3 沿GBM(Glomerular basement membrane，GBM)呈顆粒樣沉積。其后Edgingiton證實引起HN的抗原為腎小管刷狀緣Fx1A的主要成分之一，大量存在于近曲小管上皮細胞刷狀緣。Kerjaschki等[6]在小鼠的腎小球基底膜內皮下足細胞膜沉淀物發(fā)現(xiàn)糖蛋白抗原-megalin，屬低密度脂蛋白受體家族，為鼠膜性腎病的靶抗原，形成的抗原抗體復合物與C5b-9形成膜攻擊復合物可使足細胞NADPH過氧化物酶復合體的表達上調，使活性氧在GBM產(chǎn)生，進而氧化足細胞表面脂蛋白，隨后，二聚單體NC1域IV型膠原蛋白與氧化的脂蛋白共價結合，這些結構的改變影響腎小球基底膜結構，進而影響腎小球濾過功能，產(chǎn)生蛋白尿[7]。由于人腎小球足細胞無megalin蛋白表達，故HN模型未能揭露人膜性腎病的發(fā)病機制，但該模型為探索人膜性腎病免疫機制及發(fā)現(xiàn)自身抗體奠定了基礎。

1.2新生兒同源性免疫膜性腎病的靶抗原-中性內切酶2002年，Debiec等[8,9]在少見的新生兒同種免疫性膜性腎病中發(fā)現(xiàn)腎小球原位免疫復合物，并首次發(fā)現(xiàn)人膜性腎病的相關抗體-中性內切酶抗體(Neutral endopeptidase,NEP)，這為人們進一步探索膜性腎病的發(fā)病機理奠定了基礎。研究組通過腎臟病理活檢確診新生兒膜性腎病，分析其病因在于該患兒母親是先天NEP基因缺陷，其患者母親在早期的流產(chǎn)史中被該種蛋白免疫，此次懷孕中的胎兒表達NEP，此時母體中抗NEP循環(huán)抗體經(jīng)胎盤進入胎兒體內，與胎兒腎小球基底膜足細胞結合，進而激活補體，使足細胞受累，隨之引起胎兒腎單位損傷、腎小球發(fā)生病理變化，導致新生兒膜性腎病。2004年，Debiec研究組[10]對5組家庭的核型分析，認為母體金屬彈力酶 (Metallomembrane endopeptidase,MME)基因缺失引起中性內切酶缺陷，在妊娠期間母體即可產(chǎn)生抗胎兒NEP的抗體。另外，有研究指出患兒母親產(chǎn)生的補體IgG亞型不同，則患兒膜性腎病的嚴重程度有差異，并明確指出母體產(chǎn)生的抗體中IgG1比例越高，患兒患病越嚴重。因此檢測孕婦血清中抗NEP抗體及核型分析可以早期發(fā)現(xiàn)新生兒膜性腎病，從而其預防該病的發(fā)生，降低新生兒同源免疫性膜性腎病的發(fā)病率[11]。

1.3成人膜性腎病主要靶抗原-M型磷脂酶A2受體為了深入研究特發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機制，在2009年，Beck等[12]人對IMN患者腎小球提取物采用Western blot方法獲得一種與疾病相關的蛋白質，由質譜分析等方法證實存在一種185-kD的腎小球蛋白，即M型磷脂酶A2受體(M-phospholipase A2 receptor,PLA2R)為引起特發(fā)性膜性腎病的靶抗原。該蛋白可在70%的特發(fā)性膜性腎病患者中表達,并且在繼發(fā)性膜性腎病等其他對照組患者中未檢測到該種蛋白。PLA2R1主要表達于腎小球基底膜足細胞，屬于甘露糖受體家族[12]，其結構包括N末端富含胱氨酸區(qū)域(Cysteine-rich,CysR)、Ⅱ型纖連蛋白區(qū)域(Fibronectin-like type Ⅱ,FnⅡ)、8個C型凝集素區(qū)域(C-type lectin-like domain 1,CTLD1)以及跨膜區(qū)域和細胞內的C末端(圖1)。該蛋白空間構想的改變可使機體產(chǎn)生抗PLA2R抗體，進而形成循環(huán)免疫復合物[13,14]，這些循環(huán)抗體可以在膜性腎病患者的血清和腎小球免疫沉淀物中被檢測到。

表1　特發(fā)性膜性腎病的靶抗原及作用機制Tab.1　Target antigens and their pathogenesis of idiopathic membranous nephropathy

圖1　PLA2R分子結構Fig.1　Molecular structure of PLA2R

許多研究都說明了抗PLA2R自身抗體與特發(fā)性膜性腎病的關系，在不同國家、種族的IMN患者對PLA2R的特異性稍有差異；在不同的研究中，抗體檢出率不同。如：Beck等人在37個IMN患者中檢測出26個患者抗PLA2R自身抗體陽性(70%)[12],而歐洲IMN患者抗體陽性率為78%[15];隨后，伊朗、日本和中國的研究顯示該抗體陽性率分別為74%、53%、82%[16-18]。除地域和人種的差異，其原因還可能是由于檢測方法或小樣本測試的差異等因素所引起的，研究表明PLA2R與新生兒膜性腎病相關性不大，其主要是成人特發(fā)性膜性腎病靶抗原。

1.41型血小板反應蛋白7A域盡管對自身抗體的研究發(fā)現(xiàn)，大約70%的IMN患者可以采用特異性高的抗PLA2R自身抗體檢測來診斷，但還有少數(shù)的患者體內未檢測到該抗體。2014年，Tormas等[19]人在154例抗PLA2R1抗體陰性的IMN患者中，發(fā)現(xiàn)其中15例患者血清存在抗1型血小板反應蛋白7A域(Thrombospondin Type-1 Domain-Containing 7A,THSD7A)抗體，THSD7A表達于足細胞膜上，其抗體亞型與PLA2R抗體相同，均為IgG4亞型[19]。THSD7A與PLA2R有相似的結構和許多相似的生化特征，如N-糖基化、膜位置以及只在還原狀態(tài)下才能檢測到,但二者的存在又具有互斥性，即在IMN患者血清抗PLA2R抗體陰性的血清中才可發(fā)現(xiàn)THSD7A抗體?？筎HSD7A自身抗體可在9.7%的PLA2R陰性的患者中檢測到，在IMN患者中的檢出率大約為3%[19]。

1.5足細胞靶抗原及其自身抗體的致病機制雖然目前尚未清楚IMN確切的發(fā)病機制，但眾多研究表明抗體水平與足細胞表面成分和疾病的活動進展密切相關。自2009年人們發(fā)現(xiàn)PLA2R，普遍認為機體產(chǎn)生的自身抗體與足細胞靶抗原形成的原位免疫復合物，可激活補體，形成膜攻擊復合物，從而引起腎小球損傷和蛋白尿的形成[20]。2009年Beck[12,20]的研究證實了IMN患者中抗PLA2R自身抗體的類型主要是IgG4，隨后的研究支持了這一結論，并提出繼發(fā)性膜性腎病中主要是IgG1亞型，研究還指出IMN患者體內有多種亞型的免疫球蛋白，IgG4為主要類型，其次也存在IgG1、IgG2、IgG3，但其含量有較大差異。還有觀點認為病程的不同階段，抗體亞型有差異，即原發(fā)性性膜性腎病早期階段可能主要以IgG1為主，而發(fā)展的后期階段IgG4占優(yōu)勢[21-23]。

為進一步研究患者體內產(chǎn)生的自身抗體是通過怎樣的潛在的病理機制激活補體引起足細胞損傷，研究者進行了動物實驗及移植后膜性腎病等研究。由于傳統(tǒng)上認為IgG4類抗體不能激活經(jīng)典補體途徑，因此可能是機體產(chǎn)生的少量IgG1類抗體激活了經(jīng)典補體途徑，但膜性腎病患者的C1q水平低甚至檢測不到，故可排除經(jīng)典的補體激活途徑，間接證實了IMN是通過其他途徑激活補體系統(tǒng)的。而旁路途徑或甘露糖交聯(lián)凝集素途徑可能是該病的補體激活途徑，含量較高的甘露聚糖凝集素的結合物可在特發(fā)性膜性腎病患者被檢測，支持了這一觀點[24,25]。補體活化后形成C5b-9，通過對足細胞DNA損傷、氧化劑和蛋白酶作用、及對足細胞裂孔蛋白的破壞等，導致濾過屏障破壞，從而產(chǎn)生蛋白尿。

研究者認為特發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機制可能與補體的激活不相關，可能是自身抗體本身介導的一種激活反應。足細胞表面PLA2R的生理功能還不是很清楚，抗PLA2R自身抗體可能干擾了PLA2R的正常功能，或是作為異常的激活劑或抑制劑，而引起足細胞的病理改變[26]。

2　特發(fā)性膜性腎病相關非足細胞靶抗原及其作用機制

2.1抗醛糖還原酶、超氧化物歧化酶Prunotto[27]發(fā)現(xiàn)IMN患者血清中存在抗醛糖還原酶(Aldose reductase,AR)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 2,SOD2)的兩種抗體，并且患者腎組織中，這兩種物質相應的抗體、補體成分共存在于足突細胞電子致密物中。AR屬于醛酮還原酶家族可催化NADPH介導的脂肪族和芳香族醛或酮的還原，它特殊的功能是可把糖轉化成山梨醇，并調節(jié)組織的緊張性和滲透性。正常腎臟組織的AR被髓質的腎小管上皮細胞遏制而不能表達；SOD2是保護細胞，防止氧化。在腎臟SOD2廣泛的表達于腎小管上皮細胞，尤其是皮質區(qū)可防護腎臟缺血再灌注損傷，但并沒有報道證實腎小球上也表達SOD2。有動物研究表明腎小球損傷是由足細胞產(chǎn)生的氧自由基引起足細胞膜損傷，當機體存在抗AR和SOD2抗體時，就會使AR和SOD2失去可對細胞的保護作用。然而膜性腎病的患者，在采用還原性藥物進行治療后，可有效地緩解蛋白尿癥狀。因此， AR和SOD2抗體阻礙了這兩種還原性蛋白在機體中的作用，使氧化應激作用引起了腎小球的損傷。但兩種抗體對膜性腎病不具有特異性，AR與SOD2的在IMN患者中檢出率分別為25%～34%、28%～50%[28]。

2.2α-烯醇化酶在成人膜性腎病的患者中，不斷有其他引起疾病的靶抗原被發(fā)現(xiàn)，如α-烯醇化酶(Alpha enolase)，可能是IMN潛在的靶抗原，但α-烯醇化酶也在其他自身免疫性疾病中被檢出，對于IMN的特異性較低[29]，其致病可能與足細胞表面的抗原表達的相關。

2.3陽離子化牛血清白蛋白國外的研究[30]指出陽離子化牛血清白蛋白與膜性腎病的發(fā)生有關，同時在成人及兒童患者體內可以測得高濃度的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)及其特異性抗體，但成人血清內的BSA為中性的，而兒童患者體內的BSA帶有陽性電荷，并且只在兒童患者的腎小球內皮下沉積物中發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白及其IgG抗體。動物模型研究中，只有給予動物注射陽離子牛血清白蛋白才會引起MN[31]。因此，陽離子BSA引起MN的機制可能是進入血液循環(huán)的該物質會與腎小球毛細血管網(wǎng)上的陰離子結合，而形成的原位免疫復合物，激活體內的免疫反應，引起腎小球損傷。

3　用于膜性腎病診斷的自身抗體

目前，已發(fā)現(xiàn)的自身抗體中，唯有PLA2R與IMN的相關性和特異性較高，許多研究表明在特發(fā)性膜性腎病的進程中，PLA2R自身抗體含量的變化與疾病的嚴重程度及病程進展密切相關[32]，復發(fā)時抗體滴度會再度升高[33]。當采用藥物如糖皮質激素、環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗等治療一段時期后，可以觀察到患者病情改善的同時PLA2R抗體濃度也下降，并且血清抗體消失要早于蛋白尿的消失[3,34]。因此可將PLA2R自身抗體用于IMN的診斷、鑒別診斷、治療評估以及預后隨訪觀察。

早期Beck研究組采用非還原SDS-PAGE電泳和Western blot檢測到PLA2R，但該方法操作復雜、耗時、實驗技術要求高，不適用于大樣本量的臨床實驗室使用[12]。隨后發(fā)展了基于重組細胞的間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence cell based assay,IIF-CBA)，在體外重組PLA2R，使其與患者血清中含有的抗PLA2R自身抗體結合，使用熒光標記的二抗與抗原抗體復合物結合，在熒光顯微鏡下觀察到熒光物質，便證明該患者體內PLA2R抗體陽性，但其結果的判讀受主觀因素的影響較大[35,36]。為了進行高通量樣本的定量檢測，研究者將可定位激光小珠免疫測定法(Addressable laser bead immunoassay，ALBIA)應用于抗PLA2R自身抗體的檢測。該方法是使用承載著完整重組蛋白質的可定位激光小珠免疫測定平臺檢測IMN患者血清中PLA2R抗體[35,37]。ALBIA是一個特定抗原的多路激光下的免疫熒光技術，該技術中特異的抗原(PLA2R)會與內部標記兩種不同比例熒光微球共價結合，孵化后與人類血清和熒光染料標記的二抗結合，并用兩種激光分析。一種激光檢測小珠上結合的特異性目標抗原(PLA2R)，而第二種激光用來檢測小珠上與熒光二抗結合的抗原抗體復合物。ALBIA可在一個實驗中同時檢測多種抗原但所需要的血清量只需2～20 μl。該法可以避免主觀因素對結果的影響。此外，為了能夠更精確地檢測抗體濃度，Hofstra等人采用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對試驗患者血清進行測定，該方法在微孔板上包被PLA2R抗原，已稀釋的血清抗體與抗原結合，通過與酶標二抗的特異性結合，而催化底物反應，經(jīng)過酶標儀的檢測得出樣本中抗PLA2R抗體的含量。該方法可對PLA2R抗體進行定性或定量檢測，其敏感性、特異性較高，操作方便，適用于高通量檢測[21,38]。

THSD7A自身抗體只在PLA2R陰性的IMN患者中的檢出，故檢出率較低，敏感性較差，對人群中IMN患者診斷效能差。而非足細胞靶抗原AR、SOD2、α-烯醇化酶、BSA及其自身抗體的研究，雖然它們在IMN的發(fā)病機制中起一定作用，但也在其他多種疾病中發(fā)揮作用，對于IMN的診斷缺乏特異性。因此，目前這些自身抗體的檢測并未應用于IMN的臨床診斷。

4　展望

近年來，IMN的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管具體發(fā)病機制的研究仍不是很透徹，已發(fā)現(xiàn)NEP、PLA2R、THSD7A等自身抗體與該病的發(fā)病機制有關，這些抗體的發(fā)現(xiàn)推動了膜性腎病的診斷、疾病分期、預后判斷、治療策略及療效監(jiān)測的改變，并且相關自身抗體的測定也逐漸廣泛的應用到了臨床。然而，目前發(fā)現(xiàn)的自身抗體對IMN的診斷特異性與IMN診斷的金標準-腎組織活檢相比，尚有一定的差距。因此，還需要對疾病自身抗體進行進一步的研究，以期找到新的該病特異性的抗體，加深對疾病的發(fā)病機制認識，同時也可以通過多種與疾病相關的自身抗體的聯(lián)合檢測，提高特發(fā)性膜性腎病的檢出率，以減少患者接受有創(chuàng)檢查的損傷，可有助于推動膜性腎病的診斷、鑒別診斷、預后和治療策略的改進。

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[收稿2015-07-10修回2015-08-07]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.037

R392 文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1245-05

程桂雪(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事膜性腎病分子診斷方面的研究。

及指導教師：李永哲(1964年-)，男，博士，教授，主要從事自身免疫性疾病相關研究，E-mail:yongzhelipumch@126.com 。

秦曉松(1972年-)，女，博士，教授，主要從事腎病分子診斷方面研究，E-mail:qinxs@sj-hospital.org。