陳　恩　林　琳　呂賽平　陳杰妮　陳純靜　鄒學(xué)森

(江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，南昌330029)

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青霉素誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中STAT3及IL-6表達(dá)①

陳恩林琳②③呂賽平陳杰妮④陳純靜③鄒學(xué)森

(江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，南昌330029)

①本文受江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金項目(2013B006)資助。

②廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，廈門361008 。

③中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,長沙410078。

④攀枝花市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，攀枝花617000。

目的：通過構(gòu)建青霉素誘導(dǎo)的大鼠癲癇動物模型，探討STAT3及IL-6在青霉素誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中的表達(dá)。方法：腹腔注射不同劑量的青霉素，制備癲癇動物模型，觀察各組大鼠腦電圖及行為學(xué)，熒光定量PCR方法檢測各組動物IL-6及STAT3的mRNA表達(dá)量；ELISA法檢測血清中IL-6的分泌量； Western blot檢測各組動物STAT3的蛋白表達(dá)。結(jié)果：500 U/kg和800 U/kg青霉素腹腔注射均出現(xiàn)癲癇行為學(xué)發(fā)作癥狀及典型的癲癇腦電波，癲癇發(fā)作率為100%；和對照組比較，模型組大鼠IL-6以及STAT3 mRNA 水平明顯升高，血清中IL-6分泌增加，STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著性差異，但p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著增加。結(jié)論：在青霉素誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中，STAT3及IL-6起著重要的作用。

癲癇；大鼠；STAT3；IL-6

癲癇(Epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)病率僅次于腦血管疾病的第二大類疾病，是由大腦神經(jīng)元的異常反復(fù)放電所引起，以機體暫時性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的一組疾病和綜合征，臨床表現(xiàn)為運動、感覺、意識、行為、自主神經(jīng)等功能障礙[1]。青霉素作為一種廣譜抗生素廣泛應(yīng)用于臨床，但其也是一種經(jīng)典的癲癇致病劑。青霉素急性點燃動物癲癇病發(fā)作的模型己獲公認(rèn)，并被廣泛用于癲癇的電生理、生化、解剖學(xué)等方面的研究；但青霉素引起癲癇的機制仍不完全清楚，需進(jìn)一步研究。

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元關(guān)系密切，不僅起到傳統(tǒng)的支持、營養(yǎng)和保護神經(jīng)元的作用，也積極參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育及其疾病過程。因此，神經(jīng)系統(tǒng)的病變必然涉及到星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了癲癇的反復(fù)發(fā)作。星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的過程中，STAT 蛋白家族在整個分化過程中都持續(xù)被激活。STATs家族包括7個成員[2]，其中STAT3蛋白的研究倍受重視。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志GFAP的啟動子區(qū)域有STAT3的結(jié)合位點，JAK/STAT信號途徑在星形膠質(zhì)細(xì)胞增生中起著重要作用[3-5]；也有研究表明，JAK/STAT途徑在星形膠質(zhì)細(xì)胞增生中只起著微不足道的作用[6,7]，因此研究STAT3在癲癇中的作用就十分必要。

研究表明，癲癇的發(fā)病與神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)失衡有關(guān)，以神經(jīng)機制為主，免疫和內(nèi)分泌因素分別在受體、信使和基因水平對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。IL-6作為具有最廣泛的生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子之一，具有促炎和抗炎的雙向作用，同時，IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也主要依賴于STAT3的參與[8]。因此，IL-6在癲癇疾病的致病機制研究尤為必要?；诖?，本文擬通過構(gòu)建青霉素誘導(dǎo)的大鼠癲癇動物模型，探討STAT3及IL-6在青霉素誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究癲癇發(fā)病機制提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料體重(240±20)g的健康成年SD大鼠48只，購于中南大學(xué)實驗動物中心，雌雄不限。青霉素由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)；Trizol試劑購于北京達(dá)科為公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermantas； qRT-PCR試劑購自BioRad；STAT3，p-STAT3 抗體、內(nèi)參和過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司；IL-6 ELISA試劑盒購于美國R&D公司，所用引物由華大基因公司合成。

1.2方法

1.2.1癲癇動物模型的建立(1)SD大鼠分組：SD大鼠隨機分成4組，每組12只；A組為空白對照組，B組為實驗對照組；C組為500 U/kg青霉素致癲癇組；D組為800 U/kg青霉素致癲癇組。(2)植入皮質(zhì)電極：每組隨機選擇3只SD大鼠，用3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉并固定，切開頭皮，剝開顳肌等組織，暴露顱骨。待干燥后在前鹵后中線旁3.0 mm左右處各鉆一小孔，植入電極，其中一個為記錄電極，一個為參考電極，同時在耳根處另接一銅線為接地線。將所有銅線和皮膚一起縫合后單籠飼養(yǎng)，恢復(fù)7 d。(3)癲癇動物模型建立：空白對照組不進(jìn)行任何處理，在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)；500 U/kg青霉素致癲癇組為按500 U/kg體重腹腔注射青霉素；800 U/kg青霉素致癲癇組為按800 U/kg體重腹腔注射青霉素；實驗對照組為等量生理鹽水注射。(4)腦電圖記錄及行為學(xué)觀察：采用RM6240C信號處理系統(tǒng)記錄皮層腦電圖，腹腔注射青霉素后即開始記錄，采集頻率為800 Hz，掃描速度為250 ms/div，靈敏度100 μl，時間常數(shù)為0.2 s ，連續(xù)描記1.5 h。行為學(xué)變化根據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)分為6級[9]：0級為無行為學(xué)變化；Ⅰ級為SD大鼠出現(xiàn)胡須動及咀嚼；Ⅱ級為SD大鼠出現(xiàn)頭部抽搐或甩尾；Ⅲ級為SD大鼠出現(xiàn)單肢抽搐；Ⅳ級為SD大鼠出現(xiàn)多肢抽動或強直；Ⅴ級為SD大鼠出現(xiàn)四肢節(jié)律性抽搐、跌倒或翻滾。

1.2.2熒光定量PCR技術(shù)檢測IL-6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平小鼠發(fā)生癲癇后2 h取腦組織，將海馬勻漿后用用Trizol提取總RNA，將RNA樣本用MMLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系如下：5×buffer 4 μl，mRNA 2 μl，dNTP 1 μl，Oligd T 1 μl，DEPC水 11 μl，MMLV 1 μl，總共20 μl；于42℃ 15 min,95℃ 2 min進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)保存在-80℃。剩余組織凍存?zhèn)溆眠M(jìn)行Western blot實驗，或用多聚甲醛灌流固定腦組織進(jìn)行免疫組化實驗。

并利用Primer2.0及Primer-Blast設(shè)計待測基因的引物(表1)用于qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)量。所采用的qRT-PCR體系(20 μl)為：2×SYBR Premix(BioRad) 10 μl;Primers 0.2 μmol/L;cDNA 0.5 μl;qRT-PCR循環(huán)條件如下：95℃變性2 min，后以94℃變性15 s，55℃退火15 s，40個循環(huán)，每一循環(huán)結(jié)束后記錄熒光值，擴增完畢后繪制熔解曲線。采用△△Ct法計算各目的基因 mRNA的表達(dá)變化。使用BioRad CFX manager 2.0分析不同感染狀態(tài)下基因的差異表達(dá)情況。

ELISA檢測各組動物血清中IL-6分泌水平：動物在腹腔注射青霉素導(dǎo)致癲癇發(fā)作后2 h，尾靜脈取血0.5 ml，待凝固后分離血清，-20℃保存，測定前置室溫復(fù)融，混勻，4℃ 3 000 r/min離心5 min，取上清液按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測IL-6的表達(dá)。

1.2.3Western blot檢測各組動物STAT3的蛋白表達(dá)冰凍狀態(tài)下切取腦組織50 mg放入EP管，用剪刀剪碎，加入蛋白裂解液；取加入了細(xì)胞裂解液的樣本冰上孵育30 min，超聲粉碎后4℃ 12 000 r/min離心20 min,取少量用Bradford法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白經(jīng)100 g/L SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳分離，將剪好大小的PVDF膜放入甲醇溶液中10 s激活，然后將PVDF膜和厚濾紙一起浸入半干轉(zhuǎn)緩沖液中，室溫浸泡30 min；參照蛋白Marker切取所需目的蛋白所在的分離膠，浸入半干轉(zhuǎn)緩沖液中；采用恒壓20 V轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)移結(jié)束后加入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBS-T溶液)，平緩搖動的搖床平臺上于室溫溫育1 h，加入一抗，置于4℃搖床過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測蛋白表達(dá)。用成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，對掃描結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

表1　qRT-PCR引物序列Tab.1　Primers for qRT-PCR

2　結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)及腦電圖變化空白對照組和實驗對照組大鼠活動敏捷，進(jìn)水進(jìn)食正常，毛色順滑。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素后，動物逐漸反應(yīng)遲鈍，5～15 min后眼神呆滯，繼而出現(xiàn)點頭，頭部肌群抖動，扭腰等動作；20～30 min后，動物出現(xiàn)反復(fù)頭后仰性抽動并逐漸加重，之后擴展到四肢，出現(xiàn)發(fā)作性四肢及全身強直，四肢直立、背部弓起，身體扭曲，尾巴強直上翹，尖叫，全身肌肉強烈抽動，突然奔跑，跳躍，摔倒，全身強直持續(xù)抽搐，跌倒無法爬起，嚴(yán)重者死亡，整個發(fā)作以強直、陣攣表現(xiàn)為主。術(shù)后因癲癇大發(fā)作而致死6只。500 U/kg和800 U/kg青霉素注射組癲癇發(fā)作率均為100%。

空白對照組和實驗對照組大鼠為正常腦電波，無癲癇樣波形(圖1)。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組大鼠出現(xiàn)典型的尖波、棘波等癲癇放電(圖2)。

2.2各組動物開始抽搐所需時間及發(fā)作程度比較見表2、3。

2.3各組動物中IL-6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平空白對照組和實驗對照組之間，IL-6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05，n=12)。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組和空白對照組和實驗對照組相比較，IL-6以及STAT3 mRNA 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=12)。見圖3。

圖1　對照組大鼠大腦皮層腦電圖Fig.1　EEG of control group rat

圖2　實驗組大鼠大腦皮層腦電圖Fig.2　EEG of experimental group rat

表2　各組動物開始抽搐所需時間比較±s)Tab.2　Time of began to twitch ±s)

表3　各組動物發(fā)作程度比較Tab.3　Comparing attack degree of different groups

圖3　各組動物中IL-6以及STAT3 mRNA 水平Fig.3　Expression of IL-6 and STAT3 mRNANote: BL.Blank;C.Control;500 U/ kg.Intraperitoneal injection 500 U/kg penicillin;800 U/kg.Intraperitoneal injection 800 U/kg penicillin.

圖4　各組動物中IL-6分泌水平Fig.4　Expression of IL-6 proteinNote: BL.Blank;C.Control;500 U/kg.Intraperitoneal injection 500 U/kg penicillin;800 U/kg.Intraperitoneal injection 800 U/kg penicillin.

圖5　各組動物STAT3蛋白表達(dá)水平Fig.5　Expression of STAT3 proteinNote: BL.Blank;C.Control;500 U/kg.Intraperitoneal injection 500 U/kg penicillin;800 U/kg.Intraperitoneal injection 800 U/kg penicillin.

2.4各組動物中IL-6分泌水平空白對照組和實驗對照組之間，IL-6分泌水平無顯著性差異(P>0.05，n=12)。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組和空白對照組和實驗對照組相比較，血清IL-6以分泌水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=12)(見圖4)。

2.5各組動物STAT3的蛋白表達(dá)水平空白對照組和實驗對照組之間，STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05，n=12)。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組和空白對照組和實驗對照組相比較，STAT3蛋白表達(dá)水平也無顯著性差異(P>0.05，n=12)，但p-STAT3蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.05，n=12)(見圖5)。

3　討論

癲癇作為腦血管疾病中的第二大類疾病，嚴(yán)重危害著人類的健康。青霉素自1928年被英國細(xì)菌學(xué)家弗萊明首先發(fā)現(xiàn)后，被廣泛應(yīng)用于臨床，但其也是一種經(jīng)典的癲癇致病劑。青霉素急性點燃動物癲癇病發(fā)作的模型己獲公認(rèn)，并被廣泛用于癲癇的電生理、生化、解剖學(xué)等方面的研究。青霉素通過抑制γ-氨基丁酸能神經(jīng)元，使內(nèi)源性抑制性突觸活動減弱，同時谷氨酸或乙酰膽堿介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞興奮性增強，導(dǎo)致癲癇發(fā)作性放電的產(chǎn)生及維持[10,11]。我們選擇500 U/kg或800 U/kg青霉素腹腔注射，大鼠出現(xiàn)以強直、陣攣表現(xiàn)為主的癲癇行為學(xué)發(fā)作癥狀，同時腦電波顯示典型的尖波，棘波等癲癇放電現(xiàn)象，成功建立了癲癇大鼠動物模型。該模型潛伏期短、持續(xù)時間久、單位時間內(nèi)放電次數(shù)多，與人類的癲癇放電類似，可以很好地用于進(jìn)一步的研究。

STAT蛋白家族是一組可以被許多細(xì)胞因子、生長因子和其他刺激所激活的信號通路分子，目前已發(fā)現(xiàn)7種STATs，以STAT3的研究最為深入[12]。STAT3 是一種存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯(lián)的雙功能蛋白。受到刺激后，STAT3 在一個特定的酪氨酸位點(Tyr705)發(fā)生磷酸化，激活的 STAT3形成同源或異源二聚體而轉(zhuǎn)移至胞核，然后與特定的啟動基因結(jié)合，如早期即刻基因 c-fos 和 jun-B 啟動基因等[13-15]。STAT3 在腦內(nèi)的激活可以由多種因素所引起，如腦缺血、炎癥刺激及癲癇等[16-18]。IFN-γ、IL-6、IL-10的信號傳導(dǎo)都需要STAT的參與，根據(jù)靶組織的不同， STAT3激活的結(jié)果可以是增殖、存活或者凋亡。IL-6家族、IL-10的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均主要依賴于STAT3，且均受細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)調(diào)控，但對SOCS3的調(diào)控敏感性不同[19]。我們本次研究發(fā)現(xiàn)，在青霉素誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型中，腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組和空白對照組和實驗對照組相比較，IL-6的 mRNA及血清水平均明顯升高，STAT3 的mRNA水平都較對照組增高，差異有顯著性意義。說明IL-6及STAT3 在青霉素誘導(dǎo)的癲癇中起著重要作用。但是在蛋白表達(dá)水平， 空白對照組和實驗對照組之間，STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著性差異。腹腔注射500 U/kg或800 U/kg青霉素組和空白對照組和實驗對照組相比較，STAT3蛋白表達(dá)水平也無顯著性差異，但p-STAT3蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明在青霉素誘導(dǎo)的癲癇中STAT3是通過磷酸化的方式發(fā)揮作用。

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元關(guān)系密切，不僅起到傳統(tǒng)的支持、營養(yǎng)和保護神經(jīng)元的作用，也積極參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)的疾病過程。因此，神經(jīng)系統(tǒng)的病變必然影響星形膠質(zhì)細(xì)胞。癲癇發(fā)病機制研究的新進(jìn)展已表明，膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇復(fù)發(fā)中具有重要作用。研究報道STAT3作為一個星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)展的重要的調(diào)節(jié)因子，主要是通過氧化磷酸化和線粒體呼吸爆發(fā)的作用發(fā)揮作用[20]。因此，對STAT3的抑制，可以通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞活性或/和抑制線粒體的失能來去除其疾病修飾效應(yīng)，作為癲癇病治療的有效靶點。

我們檢測到模型組和對照組相比較，IL-6的 mRNA及血清水平均明顯升高，和Liimatainen等[21]報道的相一致，但是對IL-6的升高在癲癇中的作用仍存在爭議。有報道認(rèn)為癲癇發(fā)作后，可以激活腦內(nèi)的免疫程序，引起IL-6 水平升高，并可進(jìn)一步促進(jìn)癲癇的發(fā)作[22]。也有文獻(xiàn)認(rèn)為癲癇發(fā)作后引起 IL-6 水平升高可能是對嚴(yán)重的邊緣性癲癇的適應(yīng)，可能對神經(jīng)存活具有重要性[23]。這個還需要進(jìn)一步的研究。同時，IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴于STAT3的參與[8]。IL-6與其膜受體結(jié)合后，激活STAT3，使其二聚化進(jìn)入核內(nèi)啟動多種基因轉(zhuǎn)錄活化，啟動多種效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等。在癲癇動物模型中，可能是腦內(nèi)IL-6的增加，引起STAT3的活化，活化的STAT3引起識別受體的進(jìn)一步活化，通過一系列信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致IL-6表達(dá)增加，形成持續(xù)的癲癇狀態(tài)。是否存在這種正反饋循環(huán)，還需進(jìn)一步驗證。

有研究報道，300、500、700及800 U/kg青霉素腹腔注射均可以建立大鼠癲癇疾病動物模型[24,25]。本研究選擇500 U/kg及800 U/kg青霉素腹腔注射，目的是為了排除模型動物中IL-6及STAT3的變化不是因青霉素劑量所引起，實驗結(jié)果也證實了我們的假設(shè)，即IL-6及STAT3的變化與青霉素用量之間無必然聯(lián)系。本文研究證明，在青霉素誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中，STAT3及IL-6起著重要的作用，本文將為進(jìn)一步深入研究癲癇的致病機制提供一個新的思路。

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[收稿2015-11-11修回2016-03-10]

(編輯張曉舟)

Expression of STAT3 and IL-6 in epilepsy rat caused by penicillin

CHEN En,LIN Lin,Lü Sai-Ping,CHEN Jie-Ni,CHEN Chun-Jing,ZOU Xue-Sen.Clinical Laboratory,Jiangxi Province Tumor Hospital,Nanchang 330029,China

Objective:To investigate the expression of IL-6 and STAT3 in the epilepsy rat caused by penicillin.Methods: The model of epilepsy in rats was made by abdominal injecting penicillin.Then the EEG and behavior was observed in each group and the level of IL-6/STAT3 transcription and cytokine IL-6 secretion in different groups was compared using qRT-PCR and ELISA respectively.The protein expression of STAT3 was detected using Western blot.Results: 500 U/kg and 800 U/kg rats injected penicillin were induced epilepsy and show typical epileptic seizures behavioral and brain waves,seizures was 100%;the level of IL-6/STAT3 transcription and IL-6 secretion in the model of epilepsy was significantly higher than control.There was no significant difference in the expression of STAT3 protein levels,but a significant increase in p-STAT3.Conclusion: Expression of STAT3 and IL-6 plays an important role in the Epilepsy Rat caused by penicillin.

Epilepsy；Rat；STAT3；IL-6

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.006

R741.02文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1112-06

陳恩(1982年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主管檢驗師，主要從事分子免疫方面的研究，同時供職于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，E-mail:cheneng3821@sina.com。

及指導(dǎo)教師：鄒學(xué)森(1961年-)，男，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫檢測方面的研究，E-mail:tom445x@126.com。