王浩　駱雷鳴

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血小板C型凝集素樣受體-2與血栓性疾病研究進(jìn)展

王浩駱雷鳴

王浩　教授

血小板黏附、激活及聚集在暴露的內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是止血過程必不可少的步驟。此步驟涉及多個(gè)環(huán)節(jié)及多個(gè)血小板受體-配體反應(yīng)。其中,血小板黏附反應(yīng)主要涉及的受體為血小板糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-V-IX復(fù)合物與整合素,激活與聚集反應(yīng)主要涉及GPVI及C型凝集素樣受體-2(C-type lectin-like receptors-2, CLEC-2)[1-3]。

CLEC-2是近年發(fā)現(xiàn)的在血小板表面表達(dá)的信號(hào)受體,在最初通過生物信息學(xué)技術(shù)鑒定CLEC-2之后,利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及印跡雜交(northern blot)分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)CLEC-2 mRNA在肝臟細(xì)胞、多種造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞及粒細(xì)胞)中有表達(dá)[4]。后來發(fā)現(xiàn)CLEC-2蛋白在人類血小板、巨核細(xì)胞系、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝臟枯否細(xì)胞均有表達(dá)[5-6]。相比而言,CLEC-2在血小板和巨核細(xì)胞內(nèi)相對(duì)特異表達(dá),而在其他類型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較低[7]。既往研究發(fā)現(xiàn),CLEC-2激活后可以誘導(dǎo)血小板聚集。本文就CLEC-2與血栓性疾病的研究進(jìn)展綜述如下。

1　結(jié)構(gòu)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

CLEC-2是在研究蛇毒蛋白(rhodocytin)引起凝血及血栓形成的血小板受體時(shí)鑒定出來的。Rhodocytin依賴Src家族激酶激活血小板,但并不依賴膠原受體GPVI/FcRγ鏈復(fù)合物,而后者是已知經(jīng)典的依賴Src激酶激活血小板的受體途徑[8],所以推測(cè)有另一種受體途徑介導(dǎo)了rhodocytin所誘導(dǎo)的血小板聚集作用。最終應(yīng)用rhodocytin親和色譜法及質(zhì)譜分析法確定CLEC-2是rhodocytin在血小板表面的受體[3]。

CLEC-2是一種32～40 kDa的Ⅱ型跨膜受體,攜帶一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。C型凝集素通過碳水化合物識(shí)別域以一種鈣離子依賴模式與碳水化合物結(jié)合,而CLEC-2屬于非典型的C型凝集素樣蛋白,同樣含有與碳水化合物識(shí)別域同源的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域,但是缺乏與糖和鈣離子結(jié)合的共有序列[4]。CLEC-2是凝集素受體家族第一個(gè)通過酪氨酸激酶依賴途徑刺激血小板聚集的成員。

CLEC-2 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要利用FcRγ的胞漿側(cè)尾部的免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)[9],每個(gè)ITAM包含2個(gè)保守的YXXL序列,由6～12個(gè)氨基酸分開,rhodocytin與CLEC-2發(fā)生配體受體反應(yīng)后使YXXL磷酸化,與Syk的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,引發(fā)激酶活化。CLEC-2擁有單個(gè)YXXL,其可以通過2個(gè)磷酸化的受體之間通過串聯(lián)的SH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行橋接形成二聚體,1個(gè)Syk的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域與2個(gè)分子的磷酸化的YXXL以2:1形式結(jié)合[10-11],而后激活Syk。CLEC-2激活Syk后啟動(dòng)適配體及效應(yīng)蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),下游信號(hào)分子與GPVI一致,包括LAT、SLP-76、Vav1/3的酪氨酸磷酸化,效應(yīng)蛋白包括Btk及磷脂酶Cγ2 (phospholipase Cγ2, PLCγ2)[12],并最終激活PLCγ2并募集PLCγ2至細(xì)胞膜[13-14]。人類血小板CLEC-2的激活嚴(yán)格依賴ADP、血栓素A2(thromboxane A2, TxA2)及肌動(dòng)蛋白聚合的反饋反應(yīng)[15]。另外,CLEC-2通過調(diào)節(jié)PI3K及PKC的下游信號(hào)分子Akt及MAPK,引起糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)3α/β的磷酸化及抑制,增強(qiáng)血小板聚集及分泌[16]。CLEC-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑見圖1[17]。

目前唯一已知的CLEC-2內(nèi)源性配體是podoplanin,在脈管系統(tǒng)外的多種細(xì)胞表達(dá)[18]。Rhodocytin是CLEC-2外源性配體,是一種強(qiáng)力血小板激活蛋白,由馬來亞蝮蛇分離獲取[3]。另外,鹽藻多糖作為血友病的治療藥物,可以激活血小板,縮短血友病患者出凝血時(shí)間,其激活血小板功能在CLEC-2敲除的小鼠血小板被抑制,提示鹽藻多糖是一種新型CLEC-2激動(dòng)劑[19]。

圖1　CLEC-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

一種新型非細(xì)胞毒的5-硝基苯甲酸鹽化合物2CP是目前第一個(gè)確定的血小板CLEC-2拮抗劑[20],其利用與podoplanin相同的結(jié)合單元直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CLEC-2,抑制podoplanin誘導(dǎo)的血小板激活。

CLEC-2的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還可能與雙重特異性磷酸酶3(dual-specificity phosphatase 3,DUSP3)有關(guān)[21]。DUSP3在人和小鼠血小板高度表達(dá),在DUSP3缺陷的小鼠的血小板,由膠原受體糖蛋白VI和CLEC-2介導(dǎo)的血小板聚集和顆粒釋放反應(yīng)選擇性受損。與野生型小鼠相比,DUSP3缺陷的小鼠更加不易發(fā)生膠原和腎上腺素誘導(dǎo)的血栓形成。在分子水平,DUSP3缺陷抑制了Syk酪氨酸磷酸化,隨后抑制了PLCγ2磷酸化和鈣離子流動(dòng),從而抑制了血小板激活。

2　與血栓性疾病關(guān)系研究

由于CLEC-2潛在的血小板活化作用,推測(cè)其可能成為抗血栓藥物的靶點(diǎn)[22],但是CLEC-2敲除小鼠的致命性,使得關(guān)于該受體在凝血及血栓形成中的功能研究變得非常困難。第一項(xiàng)直接涉及此問題的研究,是通過抗體來免疫耗竭小鼠血液循環(huán)中的CLEC-2完成的,靜脈內(nèi)注射單克隆抗CLEC-2 IgG抗體INU1 可導(dǎo)致血小板表面受體下調(diào)超過6 d[23]。 與抗體(JAQ1)介導(dǎo)的GPVI下調(diào)類似,血小板計(jì)數(shù)在4 d后恢復(fù),新生血小板缺乏CLEC-2[24],CLEC-2耗竭的血小板對(duì)rhodocytin無反應(yīng),這種缺陷高度特異,因?yàn)檠“鍖?duì)于所有其他檢測(cè)用激活劑的激活和聚集反應(yīng)均無變化[23]。很快,有團(tuán)隊(duì)在CLEC-2缺陷的嵌合子小鼠的造血系統(tǒng)內(nèi),報(bào)道了同樣確切的反應(yīng)缺陷[25]。進(jìn)一步揭示了CLEC-2對(duì)于穩(wěn)定血小板聚集的重要作用。

在全血液灌注分析中,CLEC-2耗竭的血小板能夠正常黏附在膠原覆蓋的表面,但隨即穩(wěn)定的聚集形式在中到高的剪切率時(shí)遭到嚴(yán)重破壞。在氯化鐵所致的腸系膜動(dòng)脈損傷在體模型中,亦可見到血栓穩(wěn)定性缺陷,證據(jù)是正常血小板可黏附在損傷的血管壁,但是CLEC-2耗竭的血小板卻阻礙了血栓形成過程[22]。與此一致,Suzuki-Inoue 等描述了CLEC-2缺陷的血小板如預(yù)期一樣對(duì)Rhodocytin無反應(yīng),但對(duì)經(jīng)典的血小板激活劑如膠原、凝血酶及ADP等誘導(dǎo)血小板聚集有正常反應(yīng),包括對(duì)膠原、層粘連蛋白及纖維蛋白原等不同基質(zhì)的黏附反應(yīng)亦正常,然而CLEC-2嵌合體血小板在血栓形成方面發(fā)生了障礙,聚集穩(wěn)定性出現(xiàn)了異常[25]。基于這些結(jié)果,可以推測(cè)CLEC-2通過“接手”GPVI的血小板募集功能推動(dòng)血栓生長(zhǎng),與膠原接觸無關(guān)。利用抗體同時(shí)阻斷GPVI及CLEC-2可使凝血功能發(fā)生障礙,動(dòng)脈內(nèi)血栓形成嚴(yán)重受阻[26]。然而,與這些研究相反,其他學(xué)者在體外研究中發(fā)現(xiàn)CLEC-2耗竭的血小板聚集功能正常[27]。出現(xiàn)這些矛盾結(jié)果的原因暫不明。 CLEC-2在止血過程中似乎扮演了一個(gè)小角色,因?yàn)樵诓糠盅“宕嬖贑LEC-2缺陷的的小鼠,出血時(shí)間沒有延長(zhǎng)或者僅僅中度延長(zhǎng)[23]。

既往推測(cè)血小板(hem)ITAM、GPVI 及CLEC-2幾種受體之間可以互相補(bǔ)償以防止失血[3],因?yàn)橛行┤狈PVI的患者和小鼠只是表現(xiàn)出很輕微的出血傾向[28]。這個(gè)問題非常重要,因?yàn)樯婕暗皆趯?duì)有(hem)ITAM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有部分缺陷的患者進(jìn)行針對(duì)其他各自的(hem)ITAM受體治療時(shí),可能引起不可控制的出血。目前涉及血小板之間交互作用的CLEC-2的生理配體尚不明了。推測(cè)其可以在活化的血小板上表達(dá)或固定[23]。有團(tuán)隊(duì)推測(cè)CLEC-2的親同種抗原交互作用可能在此發(fā)揮作用[25],但這種觀點(diǎn)亦被其他人所質(zhì)疑。

因?yàn)檠“宓募せ钤谘ㄐ纬芍兄陵P(guān)重要,因此檢測(cè)在體血小板激活對(duì)于鑒定病人是否處于血栓風(fēng)險(xiǎn)及監(jiān)測(cè)抗血小板治療效果有重要意義[29]。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)個(gè)體血漿中可溶性CLEC-2(soluble CLEC-2,sCLEC-2)濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),10名健康個(gè)體平均濃度為(97 ± 55) pg/ml,同時(shí)25例糖尿病患者為(149 ± 260) pg/ml,糖尿病患者有升高趨勢(shì),可能反映了在體血小板激活情況,提示sCLEC-2作為在體血小板激活情況的生物標(biāo)記物有重要臨床意義。

3　展望

因?yàn)镃LEC-2缺陷小鼠在影響血栓形成的同時(shí)沒有明顯增加出血傾向,推測(cè)CLEC-2可能是抗血小板藥物的一個(gè)良好的靶點(diǎn),安全性更高。因此,進(jìn)一步深入研究CLEC-2將對(duì)動(dòng)脈血栓的治療和預(yù)防提供新的思路。

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R 543.31

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.004

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