殷海松，邊艷慧，湯衛(wèi)華，范栩嘉，劉鵬，喬長(zhǎng)晟，*（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津0050；.天津輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津0050；.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)），天津00457）

出芽短梗霉聚蘋果酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

殷海松1，2，邊艷慧3，湯衛(wèi)華2，范栩嘉3，劉鵬2，喬長(zhǎng)晟3，*
（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350；2.天津輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津300350；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)），天津300457）

在5 L發(fā)酵罐上，對(duì)出芽短梗霉PMLA發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，確定出芽短梗霉PMLA發(fā)酵的最優(yōu)條件。由試驗(yàn)結(jié)果可知：優(yōu)化的發(fā)酵溫度為分階段調(diào)節(jié)，即0～24 h設(shè)定發(fā)酵溫度為30℃，24 h以后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為25℃；攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min；通風(fēng)比1∶1.2。在此條件下，出芽短梗霉PMLA發(fā)酵獲得的最大生物量為38.7 g/L；聚蘋果酸產(chǎn)量為45.2 g/L；生產(chǎn)強(qiáng)度為0.38 g/（L·h）和PMLA分子量為8 412 Da。

出芽短梗霉；聚蘋果酸；溫度；攪拌轉(zhuǎn)速；通風(fēng)比

聚蘋果酸，簡(jiǎn)稱PMLA，是一種水溶性脂肪族聚酯類化合物[1-2]，由于主鏈上含有酯鍵而被稱為聚酯類化合物，在有水的環(huán)境中可以自發(fā)降解或者發(fā)生酶促反應(yīng)而被降解。聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體，相互通過(guò)酯鍵連接而成，主要有3種結(jié)構(gòu)：α型、β型和γ 型3種，惟一存在于生物體內(nèi)的只有β型聚蘋果酸[3]?？梢杂米魉幬镙d體及微膠囊材料、生物醫(yī)學(xué)材料等[4]。生物途徑制備的聚蘋果酸主要是通過(guò)微生物發(fā)酵合成，生物合成PMLA具有突出的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)微生物發(fā)酵，產(chǎn)物均為β型、產(chǎn)物分子量高、生產(chǎn)條件溫和、生成產(chǎn)物純度較高，但微生物發(fā)酵生產(chǎn)PMLA產(chǎn)量不高[5]，成本巨大是困擾發(fā)酵制備PMLA的主要問(wèn)題。

本文旨在利用5 L發(fā)酵罐分析發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速以及通風(fēng)比3個(gè)參數(shù)對(duì)出芽短梗霉聚蘋果酸合成的影響，根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中得到的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行分階段的調(diào)控，提高發(fā)酵效率，為下一步的中試打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株

出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司贈(zèng)送。

1.1.2培養(yǎng)基

1.1.2.1斜面培養(yǎng)基

稱取馬鈴薯200 g，切成1 cm3大小的方塊，加入1 000 mL蒸餾水煮沸0.5 h，用四層紗布進(jìn)行過(guò)濾，在上清液中加入20 g剪碎的瓊脂條加熱至完全溶解，再加入20 g葡萄糖攪拌至完全溶解，補(bǔ)水至1 000 mL，pH自然。

1.1.2.2種子培養(yǎng)基

蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸銨1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L， ZnSO4·7H2O 0.005 g/L，玉米漿0.1%，CaCO320 g/L（單獨(dú)滅菌）。

1.1.2.3基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖 100 g/L，蛋白胨 35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5 g/L，MnSO40.05 g/L，CaCO320 g/L（單獨(dú)滅菌）。

1.1.3儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；SKY-2102搖床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LD5-10高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心廠；Agilent1100高效液相色譜分析儀：美國(guó)Agilent；色譜柱：凝膠色譜柱（8.0 mm× 300 mm）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法

1.2.1.1斜面培養(yǎng)

將保存于4℃的斜面取出用接種針轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面上，并置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 d～5 d。

1.2.1.2種子培養(yǎng)

取出培養(yǎng)好的新鮮斜面，在無(wú)菌操作條件下，用10 mL無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)基表面的孢子洗下，置于預(yù)先加好玻璃珠的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)搖勻，制成孢子懸液。將該孢子懸液按照10%的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)40 h。

1.2.1.3發(fā)酵罐發(fā)酵方法

接種口在火焰保護(hù)下，按照10%的接種量，將300 mL混合均勻的種子液接種到5 L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，罐內(nèi)初始裝液量為3 L，轉(zhuǎn)速為300 r/min～600 r/min，通風(fēng)比1∶1～1∶1.4，發(fā)酵溫度為恒定25、28℃及30℃，發(fā)酵時(shí)間為144 h。

1.2.2分析方法

1.2.2.1菌體量測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發(fā)酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體干重（g/L）。

1.2.2.2發(fā)酵液中PMLA的測(cè)定[6]

取10 mL發(fā)酵液于15 000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液于水解反應(yīng)釜中，同時(shí)加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸。高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)水解前后的蘋果酸的含量，兩者之差即為聚蘋果酸的產(chǎn)量。

1.2.2.3GPC測(cè)定PMLA分子量

采用凝膠滲透色譜法進(jìn)行分子量的測(cè)定，首先使用分子量能夠覆蓋聚蘋果酸分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，再結(jié)合使用高效液相色譜儀和凝膠色譜柱測(cè)定發(fā)酵液中PMLA的分子量。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換即可得出PMLA的分子量。GPC檢測(cè)PMLA分子量的條件：色譜柱為凝膠色譜柱（8.0 mm× 300 mm）；柱溫25℃；參比池溫度30℃；流動(dòng)相為0.05 mol/L Na2SO4溶液；pH自然；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量20μL。

2　結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵溫度對(duì)PMLA發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對(duì)PMLA發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖1、2、3和表1所示。

圖1　不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effectofdifferentfermentation temperature on cellgrowth

圖2　不同發(fā)酵溫度對(duì)PMLA合成的影響Fig.2　Effect of different fermentation temperature on PMLA production

圖3　不同發(fā)酵溫度對(duì)PMLA分子量的影響Fig.3　Effect of different fermentation temperature on PMLA molecular weight

表1　不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵結(jié)果比較Table 1　Comparison of fermentation results under different temperature

當(dāng)發(fā)酵溫度25℃時(shí)，獲得的PMLA產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度均為最大，分別為38.3 g/L、7 872 Da，0.32 g/（L·h）。然而菌體量則是在30℃發(fā)酵條件下最大為40.2 g/L。綜合分析溫度對(duì)出芽短梗霉菌體量、PMLA產(chǎn)量及分子量的影響，選擇分階段調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度的方式，即0～ 24 h設(shè)定發(fā)酵溫度為30℃（適合大量積累菌體），24 h以后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為25℃（適合聚蘋果酸的合成）。

2.2攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA發(fā)酵的影響

攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4、5、6和表2所示。

從圖和表中可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速400 r/min時(shí)，有利于出芽短梗霉菌體生長(zhǎng)和PMLA的合成，獲得的最大生物量、PMLA產(chǎn)量、PMLA分子量和生產(chǎn)強(qiáng)度，分別為37.7 g/L、42.7 g/L、7819 Da和0.36 g/（L·h）。由于攪拌轉(zhuǎn)速過(guò)高和過(guò)低都不利于菌體生長(zhǎng)和PMLA合成，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min和600 r/min時(shí)，聚蘋果酸產(chǎn)量和出芽短梗霉生物量分別為30.2、34.5 g/L和32.3、35 g/L，分別比攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min時(shí)降低了41.4%、24.0%和16.9%、8%。綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為400r/min時(shí)最適合出芽短梗霉聚蘋果酸的發(fā)酵，因此選定400 r/min作為聚蘋果酸發(fā)酵的攪拌轉(zhuǎn)速。

圖4　不同攪拌轉(zhuǎn)速下菌體生長(zhǎng)曲線Fig.4　Time course of cellgrowth under differentagitation rates

圖5　攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA發(fā)酵的影響Fig.5　Effectofagitation rates on PMLA synthesis

圖6　不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PMLA分子量的影響Fig.6　Effectofagitation on PMLA molecular weight

表2　不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵結(jié)果比較Table 2　Comparison of fermentation results under different agitation

2.3通風(fēng)比對(duì)PMLA發(fā)酵的影響

不同的通風(fēng)比對(duì)出芽短梗霉PMLA發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖7、8、9和表3所示。

圖7　通風(fēng)比對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Fig.7　Effectofaeration rate on cellgrowth

圖8　通風(fēng)比對(duì)PMLA合成的影響Fig.8　Effectofaeration rate on PMLA production

圖9　通風(fēng)比對(duì)PMLA分子量的影響Fig.9　Effect of aeration rate on PMLA molecular weight

表3　不同通風(fēng)比條件下發(fā)酵結(jié)果比較Table 3　Comparison of fermentation results under different aeration rate

當(dāng)通風(fēng)比為1∶1.2時(shí)，獲得的PMLA產(chǎn)量、PMLA分子量和生產(chǎn)強(qiáng)度均為最大，分別為43.4 g/L、7 919 Da，0.362 g/（L·h）。當(dāng)通風(fēng)比為1∶1和1∶1.4時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量相對(duì)較低，分別為37.9 g/L、30 g/L和5 573 Da、4 689 Da，分別比通風(fēng)比1∶1.2時(shí)降低了14.5%、31.0%和42.1%、68.9%。然而出芽短梗霉生物量則是在通風(fēng)比1∶1.4時(shí)獲得最大為40.2 g/L，可能是由于高溶氧條件有利于出芽短梗霉的快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體量積累過(guò)大，對(duì)產(chǎn)物聚蘋果酸合成不利。綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)，尤其是PMLA產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，當(dāng)通風(fēng)比為1∶1.2時(shí)最適合出芽短梗霉聚蘋果酸的發(fā)酵，因此選擇1∶1.2作為聚蘋果酸發(fā)酵的通風(fēng)比。

2.4最優(yōu)條件下的PMLA發(fā)酵過(guò)程曲線

在研究發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比等因素對(duì)聚蘋果酸發(fā)酵影響的過(guò)程中，確定攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min和通風(fēng)比為1∶1.2條件下對(duì)出芽短梗霉菌體生長(zhǎng)和聚蘋果酸的合成最有利，聚蘋果酸分子量也相對(duì)較高。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度來(lái)滿足菌體生長(zhǎng)的需求，在0～24 h調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為30℃，使菌體得到一定的積累，24 h以后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為25℃，在菌體大量積累的同時(shí)合成聚蘋果酸，優(yōu)化條件下的聚蘋果酸發(fā)酵過(guò)程曲線如圖10所示。

圖10　最優(yōu)條件下的PMLA發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.10　The PMLA fermentation curve on the optimalconditions

在優(yōu)化條件下，PMLA發(fā)酵獲得的最大出芽短梗霉生物量為38.7 g/L、聚蘋果酸產(chǎn)量為45.2 g/L和生產(chǎn)強(qiáng)度為0.38 g/（L·h）。同時(shí)獲得較高的PMLA分子量為8412 Da，分子量是評(píng)價(jià)作為藥物載體性能的重要指標(biāo)，能夠用作藥物載體的聚合物分子量范圍是1.5 kDa～ 200 kDa，在該范圍內(nèi)，適當(dāng)提高聚蘋果酸分子量，可以提高其載藥量，而當(dāng)分子量過(guò)高時(shí)，則難以穿過(guò)細(xì)胞膜而失去作為藥物載體的性能。

3　結(jié)論

在5 L發(fā)酵罐上，對(duì)出芽短梗霉在不同發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比條件下PMLA發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究，主要結(jié)論如下：

綜合分析溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比對(duì)出芽短梗霉菌體量、PMLA產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和PMLA分子量的影響，確定出芽短梗霉PMLA發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度分階段調(diào)節(jié)，即0h～24 h設(shè)定發(fā)酵溫度為30℃，24 h以后調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為25℃；攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min；通風(fēng)比1∶1.2。在此條件下，經(jīng)5L發(fā)酵罐發(fā)酵獲得的最大出芽短梗霉生物量為38.7 g/L、聚蘋果酸產(chǎn)量為45.2 g/L、生產(chǎn)強(qiáng)度為0.38 g/（L·h）和PMLA分子量為8 412 Da。

[1]Shimada K,Matsushima K,Fukumoto J．Poly-L-malic acid a newproteaseinhibitorfrom Penicillium cyclopium[J]．Biochem Biophys ResCo mmun,1969,35(5):619-624

[2]Fernandez CE,Mancera M,Holler E．High molecular weightmethyl ester of microbial poly(β,L-malic acid)Synthesisand crystallization [J]．Polymer,2006,47(19):6501-6508

[3]Nagata N,Nakahara T,Tabuchi T.Fermentative production of poly (β-L-malic acid),a polyelectrolytic biopolyester,by Aureobasidium sp[J].Biosci Biotech Biochem,1993,57(4):638-642

[4]Phillppe Guerin,MichelVert,Christian Braund,etal.Drug carriers: Optically Active Poly(β-malic acid)[J].Polymer Bulletin,1985,14 (2):187-192

[5]Pinchai N,Lee B S,Holler E.Stage specific expression ofpoly(malic acid)-affiliated genes in the life cycle of Physarum polycephalum. Spherulin 3b and polymalatase[J].FEBS Journal2006,27(3):1046-1055

[6]喬長(zhǎng)晟,姜少麗,馬正旺,等．反向高效液相色譜測(cè)定發(fā)酵液中的聚蘋果酸[J]．現(xiàn)代食品科技,2012,28(4):453-455

Optimization of Fermentation Conditions for Poly Malic Acid（PMLA）Production of
Aureobasidium pullulans

YIN Hai-song1，2，BIAN Yan-hui3，TANG Wei-hua2，F(xiàn)AN Xu-jia3，LIU Peng2，QIAO Chang-sheng3，*
（1.Schoolof Bioengineering，Tianjin Modern VocationalTechnology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin LightIndustrial Institute of Chemical Co.，LTD.，Tianjin 300350，China；3.Key Laboratory of IndustrialFermentation Microbiology（Tianjin University ofScience&Technology），Ministry ofEducation，Tianjin 300457，China）

In the 5 L fermenter，the fermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA were studied and the optimalfermentation conditions of Aureobasidium pullulans PMLA was determined.The reshlts showed that：optimization ofthe fermentation temperature was divided into stages，the fermentation temperature in the 0-24 h was 30℃，the fermentation temperature after 24 h was 25℃；agitation speed was 400 r/min；aeration rate was 1∶1.2.Under this condition，the maximum biomass of Aureobasidium pullulans PMLA fermentation was 38.7 g/L；poly malic acid production was 45.2 g/L；production intensity of 0.38 g/（L·h）and PMLA molecular weight was 8 412 Da.

Aureobasidium pullulans；poly malic acid；temperature；stirring speed；aeration rate

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.020

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZCZDTG00025）

殷海松（1980—），男（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

喬長(zhǎng)晟（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：發(fā)酵工程。

2015-11-03