何曉蒙，孔繁東（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116000）

南國梨多酚氧化酶的研究

何曉蒙，孔繁東*
（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116000）

以新鮮南國梨果實(shí)為原料，鄰苯二酚為底物，采用分光光度法研究南國梨多酚氧化酶的酶學(xué)特性。結(jié)果表明：pH和溫度對新鮮南國梨PPO活性有明顯的影響，最適pH為6.8，新鮮南國梨PPO最適溫度為40℃。進(jìn)一步研究了抑制劑抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、EDTA-2Na和各種金屬鹽 [CuSO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2]對南國梨PPO的影響，其中0.1 mmol/L的抗壞血酸對新鮮南國梨PPO活性有明顯抑制作用高達(dá)50%。南國梨PPO催化底物鄰苯二酚的酶促反應(yīng)動力學(xué)與米氏方程高度符合，R2=0.998，其動力學(xué)方程為1/[V]=0.002/[S]+0.019，最大反應(yīng)速率Vmax為52.632 U/min，米氏常數(shù)Km為0.010 5 mol/L。

南國梨；多酚氧化酶；酶學(xué)特性

人們對多種植物中的多酚氧化酶已進(jìn)行了廣泛研究，但對南國梨果肉多酚氧化酶的一些生理生化特性報(bào)道卻很少[1-4]。在南國梨的加工過程中，容易遭受酶促褐變的困擾，褐變后不僅影響外觀品質(zhì)，而且使其失去食用價值，因此，褐變是目前梨果類深加工過程中最待解決的一個問題[5]。南國梨中多酚氧化酶的活性很高[6-7]，而多酚氧化酶正是引起果蔬酶促褐變的主要原因，南國梨在加工貯藏時出現(xiàn)的機(jī)械損傷，不可避免的加快了褐變的產(chǎn)生[8-11]，通過對溫度、pH、離子各條件和酶動力學(xué)方程的綜合測定，試驗(yàn)出可以抑制多酚氧化酶的酶活性的最適條件，從而提高南國梨深加工的產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)價值，為接下來南國梨果酒的釀造研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

南國梨：市售。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器

TL.18M高速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；高速組織搗碎機(jī)：九陽股份有限公司；SHZ-3循環(huán)水真空泵上海奧克斯設(shè)備有限公司；BCD-215YH海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；WFJ7200可見光分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；磁力攪拌器：上海滬西分析儀器廠有限公司；GB303電子精密天平：梅特勒托利多儀器有限公司；TG328A型電光分析天平：上海天平儀器。

1.2.2主要試劑

丙酮、鄰二苯酚、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、EDTA-2Na、Cu－SO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2：北京化學(xué)試劑公司。

1.3方法

1.3.1多酚氧化酶（PPO）粗酶液的提取[12-13]

稱取完好無色變的南國梨200 g，迅速切塊，加入50 mL冷丙酮（-22℃）混合打漿，加入100 mL冷丙酮，充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行抽濾，講濾渣溶于100 mL冷丙酮中，反復(fù)抽濾至濾渣為無色，濾渣在室溫下干燥至恒重，加入100 mL磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）4℃攪拌30 min，將液體在8 000 r/min離心20 min，取上清液為粗提液，冷藏備用。

1.3.2PPO活性的測定[14-16]

以鄰苯二酚為底物，加入緩沖液和酶液后，用紫外分光光度計(jì)檢測反應(yīng)液在420 nm處的吸光度值（A值），每隔5秒讀取一次A值，依據(jù)曲線最初的直線部分計(jì)算酶活力。以在1 min內(nèi)引起吸光度變化0.001為一個酶活力單位（U）。

1.3.3pH對PPO活性的影響[17]

反應(yīng)液中加入不同pH的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，測定不同p H時的酶活。pH范圍取4～8，溫度25℃。反應(yīng)液組成：酶液0.5 mL，鄰苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸緩沖液5 mL。

1.3.4溫度對PPO活性的影響[18-19]

用恒溫水浴鍋調(diào)整不同的溫度，使酶液和緩沖溶液處于不同的溫度中反應(yīng)一定時間，然后加入鄰苯二酚底物液反應(yīng)，檢測酶活。溫度范圍取20℃～50℃，反應(yīng)液組成：酶液0.5 mL，鄰苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸緩沖液5 mL。

1.3.5抑制劑及金屬鹽溶液對酶活性的影響[20-24]

用磷酸鹽緩沖液配置不同濃度的抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、EDTA-2Na和各種金屬鹽溶液（CuSO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2）分別取上述溶液0.5 mL，酶液0.5 mL，鄰苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸緩沖液5 mL。在25℃條件下測定PPO的活性。

1.3.6酶反應(yīng)動力學(xué)[25-27]

根據(jù)酶-底物中間復(fù)合物假說，單一底物酶促反應(yīng)機(jī)制可表示為：E+S←→ES→E+P米氏方程為V= Vmax[S]/（Km+[S]），換為雙倒數(shù)方程即為1/V=Km/Vmax×1/ [S]+1/Vmax，其中V為酶反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速度，[S]為底物濃度。由雙倒數(shù)作圖，可計(jì)算出Km與Vmax。以鄰苯二酚為底物，試驗(yàn)設(shè)計(jì)0.022、0.029、0.040、0.067、0.200 mol/L 5個不同濃度，其倒數(shù)分別對應(yīng)為45、35、25、15、5 L/mol，酶反應(yīng)動力學(xué)的研究在25℃、pH6.8條件下檢測底物添加量不同時的酶的活性，做出底物濃度－酶活的曲線，并用雙倒數(shù)作圖法做LB曲線求出Vmax和Km值，做出米氏方程。

2　結(jié)果與討論

2.1pH對酶活力的影響

pH對酶活力的影響見圖1。

圖1　pH對南國梨PPO活力的影響Fig.1　Effect ofpH on the activity of PPO from Nanguo pear

由圖1可知，pH值對PPO活力的影響較大。當(dāng)pH從3增加到5.5時，PPO活力劇烈上升，酶活力增長為原來2倍～3倍；隨著pH從5.5增加到6.8，酶活力呈現(xiàn)緩慢上升，在pH6.8時達(dá)到最大；隨后，隨著pH 從6.8增加到8.0時，酶活力呈下降趨勢，當(dāng)pH8.0時，酶活力僅為pH6.8時的44.76%?？梢钥闯?，該南國梨PPO的最適pH值為6.8。

2.2溫度對酶活力的影響

溫度對酶活力的影響見圖2。

由圖2可知，南國梨PPO反應(yīng)的最適溫度為40℃。在10℃～40℃范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高而逐漸增強(qiáng)；但當(dāng)溫度繼續(xù)上升到40℃以上時，酶活力開始迅速下降；當(dāng)溫度升高到70℃時，PPO基本失活，活力只有40℃時的15.625%。確定南國梨PPO最適溫度為40℃。

圖2　溫度對南國梨PPO活力的影響Fig.2　Effectof temperature on the activity of PPO from Nanguo pear

2.3抑制劑及金屬鹽溶液對酶活性的影響

抑制劑及金屬鹽溶液對酶活力的影響見圖3。

圖3　抗壞血酸、檸檬酸、EDTA-2Na、Na2SO4（a），亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸（b），CuSO4、CaCl2、Al（NO3）3（c），CdCl2、HgCl2、MnCl2（d）PPO活力的影響Fig．3　Effect of Ascorbic acid，citric acid，EDTA-2Na，Na2SO4（a），sodium bisulfite，L-cysteine（b），CuSO4，CaCl2，Al（NO3）3（c），CdCl2，HgCl2，MnCl2（d）on the activity of PPO from Nanguo pear

以抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、Na2SO4、Na2SO4、EDTA-2Na等抑制劑和各種金屬鹽溶液[CuSO4、CaCl2、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2]作為效應(yīng)物，研究抑制劑和Cu2+、Ca2+、Al3+、Cd2+、Hg2+、Mn2+對南國梨PPO活力的影響。在pH=6.8的磷酸緩沖液中，在40℃條件下，以鄰苯二酚為底物測定酶的相對活力[28-29]。由圖3 a和圖3b可知，抗壞血酸在較低濃度時，對PPO的抑制作用高達(dá)50%，是所有抑制劑中效果最顯著的。檸檬酸對PPO的作用并不明顯，亞硫酸氫鈉、L-半胱氨酸、EDTA-2Na、Na2SO4對PPO均有一定程度的抑制作用，并隨著濃度增加抑制作用微量增強(qiáng)。由圖3 c可知，Cu2+、Ca2+、Al3+對南國梨PPO沒有影響或者說影響很微小。由圖3d可知，Cd2+、Hg2+、Mn2+都可以將PPO激活約20%，但它們的激活程度不會很大。

2.4酶反應(yīng)動力學(xué)

酶反應(yīng)動力學(xué)直線見圖4。

圖4　南國梨PPO酶促反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線Fig.4　Lineweaver-Burk plotof PPO in Nanguo

由圖4可知，5個不同底物濃度擬合得到的直線方程為1/[V]=0.002/[S]+0.019，R2為0.998，該方為酶促反應(yīng)動力學(xué)方程。從動力學(xué)方程上看，南國梨PPO催化鄰苯二酚的反應(yīng)與米氏方程非常吻合，表明南國梨PPO酶動力學(xué)方程符合米氏方程，通過米氏動力學(xué)方程求得該酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax為52.632 U/min，米氏常數(shù)Km為0.010 5 mol/L。

3　結(jié)論

1）南國梨中含有大量的PPO，在榨汁加工過程中，極易快速發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，因此，加工過程中需有效抑制PPO活性來降低褐變速度。pH和溫度對南國梨PPO活性有明顯的影響，其最適pH為6.8，最適溫度為40℃。在加工過程中，可通過調(diào)節(jié)pH和溫度來降低南國梨PPO活性，減少褐變的發(fā)生。

2）抑制劑和金屬離子對南國梨PPO均有不同影響，其中0.1 mmol/L的抗壞血酸對PPO的抑制作用最顯著高達(dá)50%；2.5 mmol/L的Hg2+對PPO的激活能力最強(qiáng)，達(dá)到125.5%。

3）南國梨PPO催化底物鄰苯二酚的酶促反應(yīng)動力學(xué)與米氏方程高度符合，R2=0.998，其動力學(xué)方程為1/ [V]=0.0002/[S]+0.019，最大反應(yīng)速率Vmax=52.632 U/min，米氏常數(shù)Km=0.010 5 mol/L。

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Research of Nanguo Pear Polyphenol Oxidase

HE Xiao-meng，KONG Fan-dong*（College of Food Science，Dalian Polytechnic University，Dalian 116000，Liaoning，China）

Fresh Nanguo pear as raw material，catechol as substrate，using spectrophotometric study of southern pear enzymatic characteristics of polyphenol oxidase.The results showed that：p H and temperature had a significant effect on fresh Nanguo pear PPO activity and the optimum pH was 6.8，fresh pear PPO optimum temperature was 40℃.Further study of the inhibitor of ascorbic acid，citric acid，sodium bisulfite，L-cysteine，EDTA-2Na and various metal salts[CuSO4，CaCl2，Na2SO4，Al（NO3）3，CdCl2，HgCl2，MnCl2]effectof southern pear PPO，where 0.1 mmol/L of ascorbic acid on fresh pear PPO activity was sign if icantly inhibited by up to 50%.Nanguo pear PPO enzymatic catalytic substrate catechol reaction kinetics and the Michaelis-Menten equation height accord，R2=0.998，its kinetic equation 1/[V]=0.002/[S]+0.019，maximum reaction rate Vmaxto 52.632 U/min，the Michaelis constant Kmof0.010 5 mol/L.

Nanguo pear；polyphenoloxidase；enzymatic characterization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.008

何曉蒙（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

孔繁東（1958—），男（漢），教授，研究方向：蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用。

2015-05-28