蔡卓平,劉偉杰,駱育敏,吳皓,刁盼盼,段舜山

1.廣東省生態(tài)學(xué)會(huì),廣州 510600

2.暨南大學(xué)生態(tài)系,廣州 510632

0 前言

隨著人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,重金屬的環(huán)境污染問題日趨突出,已引起人們廣泛的關(guān)注。重金屬污染物最終可能會(huì)匯入海洋,對(duì)海洋生物產(chǎn)生毒害,破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重金屬來源主要有陸源輸入、天然源和大氣沉降,其中陸源輸入是海洋重金屬污染的常見來源[1-2]。海洋環(huán)境中監(jiān)測到的重金屬污染物通常有鎘、鉛、銅、鋅、汞、鉻等,它們具有環(huán)境殘留時(shí)間長、難以降解、可沿著食物鏈傳遞富集、危害不可逆性等特點(diǎn)。例如重金屬鉛Pb 能導(dǎo)致生物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損壞,也能引起腎臟、肝臟和大腦功能的衰竭;重金屬鎘Cd對(duì)人類可以產(chǎn)生“三致性”危害(致癌、致畸、致突變)。這些重金屬污染物進(jìn)入近海水體后,可通過食物鏈傳遞,威脅到人類健康[3-4]。海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)最主要的初級(jí)生產(chǎn)者,此外,它們對(duì)毒物敏感性強(qiáng),繁殖迅速,生長周期短,容易獲得,因此它們也被認(rèn)為是一種很好的化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)測試生物[5]。米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)屬于甲藻門,裸甲藻目,凱倫藻屬,營游泳生活,細(xì)胞長15.6—31.2 μm,寬 13.2—24 μm,是常見的有毒、有害赤潮藻,屬世界廣布種,常見于溫帶和熱帶淺海水域。其早于1935年在日本地區(qū)的海灣被發(fā)現(xiàn),隨后在美洲灣、英吉利海峽等全球海域都被發(fā)現(xiàn),1998年中國南海大鵬灣、深圳灣、珠江口及內(nèi)伶仃島等一帶海域也發(fā)生過較大規(guī)模的米氏凱倫藻赤潮[6]。米氏凱倫藻具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,其誘發(fā)的赤潮給沿海國民經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失,也給人們的健康帶來威脅。本文選用米氏凱倫藻為生物研究材料,設(shè)置不同濃度的重金屬鎘和鉛處理,重點(diǎn)研究重金屬Cd2+和Pb2+脅迫對(duì)藻細(xì)胞生長的影響,分析重金屬脅迫下藻體內(nèi)抗氧化酶和光合效應(yīng)的變化情況,希望為了解重金屬脅迫對(duì)海洋微藻的毒性效應(yīng)提供參考和積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)生物材料米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)取自暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院水生生物研究中心藻種室。微藻培養(yǎng)所用的人工海水經(jīng)高壓濕熱滅菌,冷卻后用于微藻的培養(yǎng)。玻璃三角瓶預(yù)先用稀HCl浸泡24 h,經(jīng)蒸餾水沖洗干凈,烘干、滅菌備用。將已知起始密度的目標(biāo)藻種分別接種于添加f/2 培養(yǎng)基的滅菌人工海水中,玻璃三角瓶放置在人工氣候光照培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(23±1) ,℃ 光照強(qiáng)度約為80 μmol·m-2·s-1,光暗周期為12h:12h。每日定期搖晃玻璃三角瓶,隨機(jī)改變其位置以減少其他因素作用。實(shí)驗(yàn)開始前預(yù)先對(duì)藻種活化及擴(kuò)大培養(yǎng),并選取對(duì)數(shù)生長期的海洋微藻用于實(shí)驗(yàn)。所用的CdCl2和PbCl2均購自上海阿拉丁試劑有限公司,分析純,純度≥99.8%。

1.2 研究方法

培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌冷卻后,分裝于150 mL玻璃三角瓶中,每瓶100 mL。選取對(duì)數(shù)生長期藻種進(jìn)行接種,初始接種濃度為1.0×105個(gè)·mL-1。重金屬離子的工作液由儲(chǔ)備液由培養(yǎng)基稀釋得到,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置重金屬Cd2+濃度梯度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1;設(shè)置Pb2+濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1。每個(gè)處理(含對(duì)照組)設(shè)置3 個(gè)平行重復(fù),培養(yǎng)96 h。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)觀測藻細(xì)胞的生長繁殖,并繪制生長曲線并計(jì)算比生長速率(μ)。比生長速率(μ)以藻細(xì)胞數(shù)均值為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),按照下面公式進(jìn)行計(jì)算:

式中:Nt和N0分別為t(96 h)時(shí)刻和t0(初始接種)時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)。在比生長率速率基礎(chǔ)上,采用概率單位-濃度對(duì)數(shù)法繪制曲線,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算96 h的半數(shù)抑制濃度(EC50)。

參照有關(guān)文獻(xiàn)[7-8]測定不同濃度重金屬Cd2+和Pb2+對(duì)米氏凱倫藻葉綠體色素含量的影響。取10 mL培養(yǎng)96 h 的藻液,經(jīng)高速冷凍離心機(jī)4 ℃,5000 g 離心15 min,棄上清液,加入5 mL 抽提液(丙酮:乙醇= 1:1),震蕩搖勻之后,4 ℃黑暗靜置24 h 后,同條件離心15 min,取上清液,用紫外-可見光分光光度計(jì)UV2450 測定440、645、663 nm 波長下上清液的吸光值,以抽提液作為空白對(duì)照,參照以下公式計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的含量(mg·L-1):

受試藻種不同濃度重金屬Cd2+和Pb2+暴露處理96 h 后,取2 mL 藻液轉(zhuǎn)移至專用測量小瓶,于暗箱中暗適應(yīng)30 min,利用植物效率儀(PAM)在室溫下進(jìn)行測定,由3000 μmol·m-2·s-1的連續(xù)光誘導(dǎo),熒光信號(hào)記錄從10 μs 開始,至2 s 結(jié)束。記錄最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)值。重金屬Cd2+和Pb2+暴露處理米氏凱倫藻96 h 后,采用南京建成公司相應(yīng)的試劑盒,參照操作手冊測定藻體超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差 (Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬鎘和鉛脅迫對(duì)米氏凱倫藻細(xì)胞生長的毒性效應(yīng)

隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長,不同重金屬處理下米氏凱倫藻的細(xì)胞密度均呈現(xiàn)增長趨勢(圖1),表明米氏凱倫藻對(duì)重金屬鎘、鉛脅迫具有一定的適應(yīng)性。從24 h 開始,較高濃度(0.6、0.8 和1 mg·L-1)重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的細(xì)胞密度明顯低于較低濃度(0、0.2 和0.4 mg·L-1)重金屬Cd2+處理下的細(xì)胞密度。隨著Cd2+濃度的提高,毒害作用增強(qiáng),藻細(xì)胞密度下降。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(96 h),0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的細(xì)胞密 度分別為56.7×104、39.4×104、33.1×104、27.5×104、24.3×104和17.6×104個(gè)·mL-1。重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的細(xì)胞密度呈現(xiàn)出類似變化趨勢。隨著Pb2+濃度的提高,米氏凱倫藻細(xì)胞受到明顯的抑制。96 h時(shí),0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的細(xì)胞密度分別為51.7×104、47.4× 104、43.9×104、31.5×104、26.2×104和18.9×104個(gè)·mL-1。結(jié)果顯示重金屬鎘和鉛脅迫對(duì)米氏凱倫藻的細(xì)胞生長產(chǎn)生毒害作用,但是兩者對(duì)米氏凱倫藻的毒害強(qiáng)度不同。實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)線性回歸方程計(jì)算重金屬鎘和鉛對(duì)米氏凱倫藻96 h 半數(shù)抑制濃度(EC50),結(jié)果分別為0.684 和0.966 mg·L-1。

2.2 重金屬鎘、鉛脅迫對(duì)米氏凱倫藻光合色素含量的影響

重金屬鎘、鉛脅迫對(duì)米氏凱倫藻葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的影響情況如圖2所示。隨著Cd2+濃度的提高,葉綠素a和葉綠素b含量呈現(xiàn)降低的趨勢,而類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)升高的趨勢。96 h 時(shí),0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下的米氏凱倫藻葉綠素含量分別為0.35、0.35、0.28、0.23、0.15 和0.08 mg·L-1,葉綠素b 含量分別為0.08、0.12、0.05、0.03、0.02 和0.02 mg·L-1,類胡蘿卜素含量分別為0.13、0.13、0.25、0.31、0.45 和0.41 mg·L-1。隨著重金屬Pb2+濃度的提高,米氏凱倫藻葉綠素a 含量降低,葉綠素b 先降低后上升,類胡蘿卜素升高。96 h 時(shí),0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下的米氏凱倫藻葉綠素a 含量分別為0.35、0.28、0.25、0.18、0.12 和0.11 mg·L-1,葉綠素b 含量為0.08、0.05、0.05、0.03、0.03 和0.14 mg·L-1,類胡蘿卜素為0.13、0.21、0.23、0.37、0.41 和0.44 mg·L-1。

圖1 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻細(xì)胞密度的影響 Figure1 Change of cell density of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖2 重金屬 Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻光合色素含量變化 Figure2 Change of photosynthetic pigment content of K.mikimotoi in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

2.3 重金屬鎘、鉛脅迫對(duì)米氏凱倫藻光合效率的影響

如圖3所示,重金屬鎘、鉛脅迫導(dǎo)致米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率降低。0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率為分別0.59、0.52、0.52、0.47、0.38 和0.29;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率分別為0.52、0.50、0.44、0.39、0.29 和0.24。

2.4 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)

2.4.1 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的超氧化物歧化酶(SOD)變化情況

0.4、0.6和0.8 mg·L-1濃度的重金屬Cd2+脅迫提高米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)活性,其平均值分別較對(duì)照提高了約36%、40%和10%;同樣地,0.1、0.2 和0.4 mg·L-1濃度的重金屬Cd2+脅迫也一定程度上提高米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)活性,其平均值分別較對(duì)照提高了約67%、42%和27%。

2.4.2 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)變化情況

不同濃度重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)變化情況如圖5。米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性隨著重金屬Cd2+濃度的提高而增強(qiáng);同樣地,米氏凱倫藻過氧化氫酶(CAT)活性隨著重金屬Pb2+濃度的提高而增強(qiáng)。0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性平均值分別為0.53、0.59、0.81、12.8、19.1 和22.4 U·mg-1;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性平均值分別為6.10、9.49、15.68、23.15、24.58 和25.10 U·mg-1。

2.2.3 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)變化情況

重金屬鎘、鉛脅迫導(dǎo)致米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)升高(圖6)。0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)較對(duì)照提高的幅度分別為39%、89%、115%、275% 和344%;0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)較對(duì)照提高的幅度分別為 47%、134%、160%、239%和282%。

圖3 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻最大光能轉(zhuǎn)化效率變化 Figure3 Change of maximal photochemical efficiency of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖4 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)變化 Figure4 Change of SOD activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖5 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻過氧化氫酶(CAT)變化 Figure5 Change of CAT activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖6 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對(duì)米氏凱倫藻丙二醛(MDA)變化 Figure6 Change of MDA activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

3 討論

因?yàn)樵寮?xì)胞壁上帶有的負(fù)電荷以及羥基和氨基等官能團(tuán),會(huì)對(duì)含有正電荷的金屬離子有著較大的親和力,所以重金屬與微藻接觸時(shí),首先是藻細(xì)胞對(duì)重金屬離子的吸附。高濃度重金屬脅迫會(huì)使得藻細(xì)胞表面的許多官能團(tuán)會(huì)與金屬離子結(jié)合而喪失活性,進(jìn)而影響藻的新陳代謝和生化反應(yīng)過程,最終使藻生長受到抑制甚至死亡[9-10]。本研究中,隨著Cd2+和Pb2+濃度的提高,其對(duì)米氏凱倫藻細(xì)胞的毒害作用增強(qiáng),藻細(xì)胞生長受抑制顯著。96 h 時(shí),0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下的米氏凱倫藻細(xì)胞密度較對(duì)照分別下降了31%、42%、51%、57%和69%;0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下的米氏凱倫藻細(xì)胞密度較對(duì)照分別下降了8%、15%、15%、39%、49%和63%,表明不同金屬與藻細(xì)胞的結(jié)合吸附程度不同,表現(xiàn)出來的毒性也有所不同。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算重金屬鎘、鉛對(duì)米氏凱倫藻的96 h 半數(shù)抑制濃度(EC50),結(jié)果分別為0.684 和0.966 mg·L-1,表明鎘和鉛都是對(duì)海洋微藻毒性較強(qiáng)的重金屬種類。

光合作用是綠色植物最基本和最重要的生命活動(dòng)過程,葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素,其含量的高低在一定程度上反映光合作用的強(qiáng)度,是植物受環(huán)境脅迫的一個(gè)重要表征指標(biāo)[11-12]。在本研究中,在較高濃度重金屬Cd2+脅迫下米氏凱倫藻的葉綠素a和葉綠素b含量降低,推測是由于重金屬進(jìn)入藻細(xì)胞后,抑制了葉綠素酸脂還原酶等物質(zhì)的活性,阻礙了葉綠素的合成;又或者是吸收進(jìn)體內(nèi)的重金屬跟葉綠體的蛋白質(zhì)上的—SH 結(jié)合,或取代了Zn2+等,破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能活性,導(dǎo)致葉綠素含量降低[13]。類胡蘿卜素能將吸收的光能傳遞給葉綠素,是光合作用不可缺少的光合色素,同時(shí),類胡蘿卜素也是植物一種重要保護(hù)劑。重金屬Cd2+和Pb2+脅迫下,類胡蘿卜素有明顯提高,推測這可能是米氏凱倫藻應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制,通過提高體內(nèi)的類胡蘿卜素來降低重金屬Cd2+和Pb2+脅迫導(dǎo)致的傷害。葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫牧己弥笜?biāo)和探針,通過對(duì)各種熒光參數(shù)的分析,可以得到有關(guān)光能利用途徑的信息,也可以反映植物受脅迫的情況[11]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),重金屬鎘、鉛脅迫下,米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率降低,96 h 時(shí)0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率為分別0.59、0.52、0.52、0.47、0.38 和0.29;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率分別為0.52、0.50、0.44、0.39、0.29和0.24,表明重金屬脅迫使得藻PSⅡ反應(yīng)中心受損,抑制了光合作用的原初反應(yīng),阻礙光合電子傳遞的過程。

丙二醛(MDA)是膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物,它能交聯(lián)脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì)從而對(duì)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能造成不良影響。MDA 含量的高低可以反映藻細(xì)胞膜脂過氧化的程度,同時(shí)也間接反映藻細(xì)胞的損傷程度[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),重金屬脅迫下,藻細(xì)胞的MDA 含量增高,表明藻細(xì)胞膜透性增加,細(xì)胞膜系統(tǒng)受損,細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞。海洋微藻在遭受到重金屬脅迫,體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧物質(zhì),使得活性氧的產(chǎn)生與清除處于一種非平衡狀態(tài),此時(shí)微藻體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)就可能增強(qiáng)以清除多余的活性氧,從而減輕由活性氧積累產(chǎn)生的氧化傷害。保護(hù)酶體系SOD、CAT 是抗氧化酶防御系統(tǒng)中的重要保護(hù)酶,能夠在一定濃度重金屬污染范圍內(nèi)對(duì)過氧化物起到清除作用,這可能是微藻對(duì)重金屬有一定抗性的主要原因之一[16]。本研究的結(jié)果顯示,較低程度的重金屬Cd2+和Pb2+脅迫下SOD 活性提高,表明較低濃度的重金屬離子能使機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)激性,清除機(jī)體產(chǎn)生過多的自由基,相對(duì)活性增強(qiáng),而隨著重金屬脅迫的增強(qiáng),活性不再增強(qiáng),甚至SOD 酶系統(tǒng)遭到了破壞,活性受到抑制。重金屬脅迫下,藻細(xì)胞的CAT 活性增強(qiáng),有利于將SOD 酶反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2分解為H2O 和O2,對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用,以減少重金屬脅迫對(duì)微藻的毒害效應(yīng)。此外,還有研究表明,海洋微藻應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的生理生態(tài)機(jī)制還包括誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)等相關(guān)蛋白基因的表達(dá)等。金屬硫蛋白是一種富含半胱氨酸、熱穩(wěn)定性、可誘導(dǎo)型非酶低分子量金屬結(jié)合蛋白,有研究表明大多數(shù)生物體內(nèi)金屬硫蛋白分子結(jié)構(gòu),由兩個(gè)大小相近的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成啞鈴型,兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過賴氨酸殘基相連[17-18]。金屬硫蛋白的-SH 能強(qiáng)烈螯合有毒的游離金屬離子,減弱重金屬離子毒性,并可將之排出體外,其在必需金屬元素的調(diào)節(jié)和非必需金屬元素的解毒等方面起到重要的作用。