柴明艷（淄博職業(yè)學(xué)院，山東淄博255314）

紅莧菜提取物抗氧化活性的研究

柴明艷
（淄博職業(yè)學(xué)院，山東淄博255314）

研究紅莧菜不同部位提取物的抗氧化活性。用75%的乙醇溶液，分別對(duì)紅莧菜的根、莖、葉3個(gè)部位進(jìn)行超聲浸提，進(jìn)一步評(píng)價(jià)各提取物清除超氧自由基、清除DPPH自由基、清除羥自由基、總抗氧化力與還原力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉部位提取物對(duì)超氧自由基清除、DPPH自由基清除和總抗氧化力最強(qiáng)；而莖部提取物清除羥自由基能力最強(qiáng)。紅莧菜具有較好的抗氧化活性，其中活性較強(qiáng)的部位為葉。

紅莧菜；提取物；抗氧化活性

近年來(lái)，隨著生活水平的提高與消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，人們對(duì)食材的營(yíng)養(yǎng)保健功能愈加重視。為此，國(guó)內(nèi)外科技工作者就藥食同源的中草藥、香辛料和果蔬等天然植物進(jìn)行了大量的相關(guān)研究[1]。紅莧菜（Amaranthus tricolor L.）作為莧科屬一年生草本植物，常以蔬菜形式供人們食用，并在我國(guó)多地廣泛種植。研究發(fā)現(xiàn)，紅莧菜性味甘涼，散痕利膽，清熱解毒，主治黃疽、痢疾、子宮癌等疾病，其功效主要來(lái)自于紅莧菜中所含多種清熱解毒、清肝利膽、抗菌消炎與提高免疫力等生理作用的活性物質(zhì)，諸如花青素及多糖等有效成分[2-5]。然而有關(guān)紅莧菜不同部位提取物體外抗氧化的效果研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文以乙醇浸提法，分別對(duì)紅莧菜的根、莖、葉3個(gè)部位進(jìn)行冷浸提取，再評(píng)價(jià)各提取物清除超氧自由基、清除DPPH自由基、清除羥自由基、總抗氧化能力與總還原力，優(yōu)選出紅莧菜抗氧化最佳活性部位，為其抗氧化功能研究提供試驗(yàn)參考與理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮紅莧菜：購(gòu)自山東淄博學(xué)院附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為莧菜屬植物；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：購(gòu)于Sigma-Aidrich公司；鄰苯三酚：南京化學(xué)試劑有限公司提供；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；去離子水由生物制藥綜合實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀：美國(guó)雷杜RT-6000；7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海佑科儀器有限公司；FA1104型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50S1型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Ar2140型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；組織絞碎機(jī)：廣東南海德豐電熱設(shè)備廠；LD5-1C離心機(jī)：北京醫(yī)療儀器修理廠；80-2B型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3提取物制備

用蒸餾水將紅莧菜植株洗凈晾干后，按根、莖、葉部位將其分開(kāi)，再分別稱取10、20、30、40、50 g上述樣品置于組織絞碎機(jī)內(nèi)進(jìn)行絞碎，再各加入75%乙醇溶液150 mL，置于室溫下浸提3 h，再用超聲波輔助提取30 min，將提取液倒出，然后續(xù)加溶劑150 mL，如此反復(fù)提取3次，分別合并各部位提取液，將其置于4 000 r/min條件下離心5min，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/mL。以上提取液滅菌后放入低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1清除超氧自由基的作用

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以鄰苯三酚自氧化法測(cè)定各提取物清除超氧自由基的抗氧化作用[6]。首先量取pH 8.20、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.6 mL，再分別加入0.2 mL紅莧菜各部位提取液，然后置于25℃下水浴20 min，再加入同溫預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液（以10 mmol/L HCl溶液配制）0.2 mL，迅速搖勻后于319 nm下每隔1 min測(cè)定其吸光值，反復(fù)10次，并以10 mmol/L HCl溶液為空白調(diào)零，對(duì)照組以等體積去離子水替代。依據(jù)測(cè)定結(jié)果，求出吸光度隨時(shí)間變化曲線的回歸方程，所得斜率即為鄰苯三酚自氧化的反應(yīng)速率V1。以同樣方法測(cè)定不加提取液時(shí)即對(duì)照組鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速率V2。然后據(jù)以下公式計(jì)算各提取液去除率：去除率/%=[（V2-V1）/V2]×100。

1.4.2清除DPPH自由基的作用

將不同部位的提取液各2 mL分別加入到干凈的10 mL具塞試管中，每管中再加入0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于515 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，同時(shí)測(cè)定溶劑作參比測(cè)定其吸光度A0，以及0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液吸光度A2，根據(jù)公式計(jì)算抑制率：抑制率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100[7]。

1.4.3清除羥自由基的作用

向10 mL試管中各加入6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、對(duì)應(yīng)提取液2 mL，搖勻后再分別加入2 mL的3 mmol/L H2O2，用去離子水定容至10 mL，混勻置于37℃水浴30 min，再以去離子水為對(duì)照，于510 nm處測(cè)定各吸光度A1，再以上法測(cè)定未加提取液時(shí)的吸光度A0，不加H2O2時(shí)本底的吸光度A2。清除率計(jì)算公式如下：清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100[8]。

1.4.4總抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化能力采用Fe3+還原試劑盒法，具體操作方法與結(jié)果處理參見(jiàn)南京建成生物工程研究所相應(yīng)的說(shuō)明書[9]。

1.4.5總還原能力的測(cè)定

往試管中分別依次加入相應(yīng)提取液、對(duì)照溶劑2.5 mL，另加入0.2 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液與1%鐵氰化鉀各2.5 mL，混勻后于50℃恒溫水浴20 min，以流水快速冷卻，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入去離子水2.0 mL以及0.1%三氯化鐵0.5 mL，混勻后反應(yīng)10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度，并以抗壞血酸為對(duì)照，其值越大表明還原力更強(qiáng)[10-11]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SE）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，顯著性以0.05 或0.01為標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與討論

2.1清除超氧自由基能力

O2失去一個(gè)電子后便成為一種強(qiáng)氧化劑，即超氧自由基O2-·，可對(duì)機(jī)體細(xì)胞與組織產(chǎn)生比羥自由基都要大的生物毒性[12]。其機(jī)理是超氧自由基能與生物大分子作用而引起細(xì)胞損傷[13]，正常情況下可由過(guò)氧化物歧化酶清除。超氧自由基還是一切氧自由基的前體，經(jīng)轉(zhuǎn)化可成為其它氧自由基?？梢?jiàn)，機(jī)體內(nèi)超氧自由基的清除還能有效減少其它氧自由基的產(chǎn)生，故其意義非常重要。

清除O2-·的能力見(jiàn)圖1。

圖1　紅莧菜提取物清除O2-·的能力Fig.1　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging O2-·

由圖1可知，紅莧菜各部位提取物均對(duì)O2-·具有清除作用，且與其劑量呈正相關(guān)，其中葉中提取物活性最強(qiáng)。

2.2清除DPPH自由基能力

DPPH自由基作為人工合成的自由基，它以氮為中心，其穩(wěn)定非常好，并在可見(jiàn)光區(qū)有特征吸收，具有使用簡(jiǎn)便、快速與重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，故常利用清除DPPH自由基的能力來(lái)評(píng)價(jià)樣品抗氧化性能的強(qiáng)弱[14-16]。為此，自1958年首次提出DPPH法后，該法便廣泛用于定量評(píng)價(jià)酚類物質(zhì)、生物試樣與食品的抗氧化能力。另?yè)?jù)報(bào)道，若受試物能清除DPPH自由基，則顯示它具有抑制腎上腺素和亞油酸氧化的功能[17]。

清除DPPH自由基的能力見(jiàn)圖2。

圖2　紅莧菜提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging DPPH free radical

由圖2可知，紅莧菜根莖葉3種提取物清除DPPH自由基的能力均較強(qiáng)，并隨生藥濃度升高而增強(qiáng)，尤其是葉提取物在生藥濃度大于4 g/mL時(shí)，其清除率可達(dá)到85%以上；其它兩種提取物的清除能力也較強(qiáng)，提示紅莧菜提取物清除DPPH自由基的能力與植株部位有一定的關(guān)系。

2.3清除羥自由基能力

細(xì)胞受損或抗氧化功能衰減時(shí)，機(jī)體內(nèi)將會(huì)生成更多的各種自由基，尤其是活性氧自由基中羥自由基具有極強(qiáng)的得電子能力，其反應(yīng)活性最強(qiáng)，毒性與危害也最大，能與活細(xì)胞中的任何生物分子、有機(jī)物（如糖類、核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等）或無(wú)機(jī)物發(fā)生快速反應(yīng)，進(jìn)而造成降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，并繼發(fā)眾多有害效應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害[18-19]。由于羥基自由基與其它分子反應(yīng)后而全部消失，故其存在時(shí)間一般不長(zhǎng)，半衰期很短。但是，由其引起的自由基鏈反應(yīng)卻能在較大范圍內(nèi)對(duì)生物體造成損害。為此，展開(kāi)體內(nèi)外羥自由基清除的研究具有重要意義，不僅有利于揭示羥自由基損傷的防治機(jī)理，還能有助于生化藥品與保健食品的篩選及評(píng)價(jià)。

清除羥自由基的能力見(jiàn)圖3。

圖3　紅莧菜提取物清除羥自由基的能力Fig.3　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging -OH free radical

由圖3可知，紅莧菜三部位提取物對(duì)羥自由基清除能力隨生藥濃度的加大而增高，尤其是在生藥濃度大于4 g/mL時(shí)，其生物活性依次為莖＞葉＞根，相應(yīng)的清除率分別為89.2%、86.5%與81.4%?？梢?jiàn)，紅莧菜三部位提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.4總抗氧化力

FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理：機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)可將Fe3+還原成Fe2+，而后者能和菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的藍(lán)色絡(luò)合物，再通過(guò)比色可測(cè)出絡(luò)合物的生成量，即可反映出待測(cè)樣品抗氧化能力的高低[20]。本試驗(yàn)定義總抗氧化力單位：在37℃時(shí)，每分鐘每毫升提取物使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化單位。由于FRAP法是針對(duì)樣品總的自由基清除能力及其還原能力，故以此來(lái)反映樣品總的抗氧化活性[21]。

采用FRAP法測(cè)定紅莧菜各部位提取物的總抗氧化能力見(jiàn)表1。

表1　紅莧菜提取物總抗氧化力Table 1　Total Antioxidant activity of Amaranthus tricolor L. extracts

由表1可知，總體上，葉的提取物抗氧化能力最強(qiáng)，莖部次之，根部最小。從表1結(jié)果還可看出，低濃度生藥條件下，各部位的抗氧化能力非常接近，而在高濃度時(shí)，其抗氧化能力差別極明顯。該結(jié)果顯示，紅莧菜提取物的總抗氧化能力不僅與其提取部位相關(guān)，還和各自的生藥濃度呈劑量依賴性。

2.5總還原能力

研究已證實(shí)，在某種程度上物質(zhì)還原能力越強(qiáng)，越不容易被氧化，其抗氧化性就越高。因此，總還原力與抗氧化活性具有相關(guān)性，并能明顯反映內(nèi)源抗氧化活性的變化，現(xiàn)已成為評(píng)價(jià)抗氧化活性的重要指標(biāo)之一[22-24]，也是物質(zhì)抗氧化作用的主要機(jī)理[25]。

紅莧菜提取物的總還原能力見(jiàn)圖5。

圖5　紅莧菜提取物總還原能力Fig.5　Totalreducing power of Amaranthus tricolor L.extracts

從圖5可以看出，隨著生藥濃度的增大，紅莧菜提取物的總還原能力逐漸增強(qiáng)，呈正的量效關(guān)系，且各部分的還原能力大小依次為：葉部>莖部>根部。在葉部生藥濃度5 g/mL和抗壞血酸濃度為50μg/mL時(shí)，二者的總還原能力基本相當(dāng)。結(jié)果表明，紅莧菜提取物具有較強(qiáng)的總還原能力，可作為電子供應(yīng)者，能與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的復(fù)合物，從而中斷鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)。

3　結(jié)論

生物體借助氧化過(guò)程可為機(jī)體提供所需的代謝能，但也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的各種氧自由基，如單線態(tài)氧、羥自由基、超氧陰離子自由基與過(guò)氧化自由基等[26]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的生成與清除處于相對(duì)平衡，因體內(nèi)自身存在抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）及過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶，它們能及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，可防止后者積累過(guò)量引起氧化應(yīng)激，以避免生物大分子不可逆的破壞而造成機(jī)體損傷、疾病與衰老[27-28]。因此，當(dāng)機(jī)體因衰老或疾患而導(dǎo)致自由基不能及時(shí)清除，可通過(guò)外源攝入抗氧化劑直接清除過(guò)量的自由基，或增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)而達(dá)到抗氧化目的[29]。

依據(jù)自由基理論[30]，當(dāng)前常用清除人工合成自由基的能力來(lái)評(píng)價(jià)活性物質(zhì)的抗氧化作用。本文就紅莧菜根莖葉三部位提取物進(jìn)行了體外抗氧化活性的探索性研究。綜合各提取物清除超氧自由基、DPPH自由基、羥自由基，及其總抗氧化力與總還原力的結(jié)果，可確定紅莧菜抗氧化的活性成分主要分布于葉片，莖部次之。其中葉部位提取物具有較強(qiáng)的超氧自由基與DPPH自由基清除能力，以及總抗氧化力；而莖部提取物對(duì)羥自由基的清除能力略強(qiáng)。研究提示，紅莧菜具有較好的抗氧化活性，并以葉部提取物活性較強(qiáng)。以上研究可為紅莧菜抗氧化活性的深入探討及其功能開(kāi)發(fā)提供科學(xué)參考。

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Antioxidant Activity of Extracts from Amaranthus tricolor L.

CHAIMing-yan
（Zibo Vocational Institute，Zibo 255314，Shandong，China）

Antioxidant activity ofextracts from different parts of Amaranthus tricolor L.was studied.Using 75% ethanolsolution，roots，stems and leaves of Amaranthus tricolor L.were conducted to ultrasonic extraction，respectively.Further more，the effects of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging superoxide free radical，DPPH radical and hydroxyl radical，total antioxidant capacity and reducing power were evaluated.The results found thatleaf extracts from Amaranthus tricolor L.showed the strongesteffects on scavenging superoxide radical and DPPH free radical，and had the biggest total antioxidant capacity，while the stem extract had the strongest effects on scavenging hydroxyl free radical.Different parts of Amaranthus tricolor L.especially leaves have a good antioxidant activity.

Amaranthus tricolor L.；extract；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.005

山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011GSF12108）

柴明艷（1983—），女（漢），講師，碩士，主要從事生物發(fā)酵方面的教研工作。

2015-06-14