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        miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達(dá)及其臨床意義

        2016-08-23 10:23:46劉志惠
        食管疾病 2016年4期
        關(guān)鍵詞:卵巢癌試劑盒引物

        劉志惠,劉 平

        miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達(dá)及其臨床意義

        劉志惠,劉 平

        目的 探討miR-146a和miR-146b在卵巢癌癌組織及配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá),及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法 收集2013年1月至2015年10月我院38例卵巢癌和配對(duì)的癌旁組織,運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)38對(duì)卵巢癌癌組織及其癌旁組織miR-146a和miR-146b的表達(dá),分析其與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性及其臨床意義。結(jié)果 熒光定量PCR顯示卵巢癌癌組織中miR-146a和miR-146b的平均表達(dá)量(6.74±2.74)和(6.34±2.14)比癌旁組織的平均表達(dá)量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明顯下調(diào)(均P<0.05)。miR-146a和miR-146b的表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 miR-146a和miR-146b的表達(dá)下調(diào)在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

        卵巢癌;miR-146a;miR-146b;臨床分期;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

        與癌癥相關(guān)的女性死亡病例中,卵巢癌排在第五位。大約80%的卵巢癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期,其中大多數(shù)患者存活時(shí)間不超過(guò)5 a[1]。臨床上經(jīng)常使用的CA125、CEA等腫瘤標(biāo)記物敏感性、特異性較差,對(duì)卵巢癌的早期診斷幫助不大[1]。近年來(lái)由于對(duì)miRNA認(rèn)識(shí)的不斷深入,其中在卵巢腫瘤的研究領(lǐng)域miRNA與卵巢癌關(guān)系的研究,包括卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、治療、化療耐藥、預(yù)后判斷等諸多方面[2]。本研究探討miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性,報(bào)道如下。

        1 材料和方法

        1.1 材料1.1.1 樣本和臨床病理資料的收集 收集2013年1月至2015年10月南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院婦科接受根治性卵巢切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃的38例卵巢癌患者,年齡38~76歲,中位數(shù)53.2歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(Federation International of Gynecology and Obstetrics, FIGO)的診斷標(biāo)準(zhǔn),38例卵巢癌病例中24例為Ⅰ期患者,14例Ⅱ期患者;15例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,23例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;透明細(xì)胞癌3例,漿液性癌32例,子宮內(nèi)膜樣癌3例。13例分化良好(GradeⅠ級(jí),G1),18例中度分化(Grade Ⅱ級(jí),G2),7例低分化(Grade Ⅲ級(jí),G3)。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療;所有病例均有病理組織學(xué)診斷支持;所有標(biāo)本都于手術(shù)取材后第一時(shí)間儲(chǔ)存在-80 ℃條件下。

        1.1.2 試劑與儀器 miRNeasy提取試劑盒(Qiagen,美國(guó)),miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(諾維贊生物公司,南京),Biotek Epoch微量核酸定量?jī)x購(gòu)自美國(guó)Biotek公司,7500熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI 公司。

        1.1.3 RT-PCR檢測(cè)基因 miRNA-146a和miRNA-146b的引物序列通過(guò)PCR引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)has-miR-146a、has-miR-146b和U6的引物序列,具體序列如下:has-miR-146a-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′,has-miR-146b-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3′,U6:5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAA-3′,并由Life Technologies公司合成。引物干粉離心后用DEPC水配制成20 μmol·L-1,置于-20 ℃冰箱備用。

        1.2 方法

        1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用miRNeasy提取試劑盒對(duì)癌組織及癌旁組織中的microRNA進(jìn)行提取。運(yùn)用分光光度法對(duì)RNA 進(jìn)行定量。按照Genecopoeia公司的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由1 μg的總RNA,與10 μL 2×RT mix,2 μL mix,1 μL oligod NTPs,1 μL Random hexamers,總體系20 μL。 25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。

        1.2.2 RT-PCR檢測(cè)miRNA-146a和miRNA-146b

        使用Taqman miRNA探針對(duì)miR-146a-5p and miR-146b-5p進(jìn)行檢測(cè),具體操作步驟按照操作說(shuō)明進(jìn)行,以2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)時(shí)PCR體系為 20 μL,包含2 μL反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,引物2 μL,反向引物2 μL,2×mix 10 μL,去RNA酶的純水4 μL。1個(gè)循環(huán)包括95 ℃30 s、95 ℃5 s和60 ℃30 s,總共40個(gè)循環(huán)。所有樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

        2 結(jié)果

        2.1 miRNA-146a和miRNA-146b的表達(dá) 卵巢癌組織中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表達(dá)量為(6.74±2.74)和(6.34±2.14),低于卵巢癌癌旁組織中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表達(dá)量(7.08±1.70)和(7.26±2.59),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.189,P=0.036;t=2.535,P=0.016),見(jiàn)圖1。

        A:miR-146a表達(dá)量 B:miR-146b表達(dá)量圖1 miR-146a和miR-146b實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

        2.2 二者臨床病理特征的相關(guān)性 腫瘤組織中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miRNA-146a和miRNA-146b表達(dá)水平越低。miRNA-146a與臨床分期亦呈負(fù)相關(guān)(P=0.039),即臨床分期越差,miRNA-146表達(dá)水平越低,見(jiàn)表1。

        表1 miR-146a和miR-146b的表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的相關(guān)性

        3 討論

        miRNA通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、增殖、血管形成、侵襲遷移等生物學(xué)過(guò)程,從而調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miRNA亦扮演著重要的角色。Iorio等[5]發(fā)現(xiàn),不同的卵巢癌組織學(xué)類型、脈管浸潤(rùn)等病理特征決定著miRNA的表達(dá)譜。如在透明細(xì)胞癌、漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌中miR-200a和miR-200c均呈高表達(dá),而在漿液性和子宮內(nèi)膜樣癌中miR-141和miR-200b呈高表達(dá)。因此,miRNA對(duì)于鑒別正常卵巢組織與癌變卵巢組織有幫助,甚至可以區(qū)分癌的組織學(xué)類型。

        研究發(fā)現(xiàn)在p53活性受抑制鼠的卵巢上皮中miR-34b和miR-34c表達(dá)水平明顯下調(diào)[6-7],基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)在miRNA編碼區(qū)上游處存在p53的結(jié)合位點(diǎn);隨后對(duì)人的p53陰性卵巢癌癌細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)miR-34b和miR-34c表達(dá)水平下調(diào);用多柔比星處理野生型p53陽(yáng)性卵巢癌癌細(xì)胞,由此推測(cè)在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中miR-34家族具有類似抑癌基因的作用。本研究顯示卵巢癌癌組織中miR-146a和miR-146b的平均表達(dá)量(6.74±2.74)和(6.34±2.14),比癌旁組織的平均表達(dá)量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明顯下調(diào)(均P<0.05),提示miR-146a和miR-146b的表達(dá)下調(diào)可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

        不同的miRNA可通過(guò)不同作用機(jī)制對(duì)卵巢癌的發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200通過(guò)抑制腫瘤血管形成、上調(diào)鈣黏蛋白的表達(dá)等兩個(gè)方面抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[8-10]。Chen 等[11]研究發(fā)現(xiàn),在卵巢癌細(xì)胞中miR-429過(guò)表達(dá),可逆轉(zhuǎn)間葉組織向上皮組織過(guò)渡,進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c 高表達(dá)的患者,2 a生存率顯著升高,與之相反miR-141低表達(dá)的人群,2 a生存率顯著升高,提示miR-200c和miR-141可作為生物標(biāo)記物判斷卵巢癌的預(yù)后[12]。本研究中腫瘤組織中miRNA-146a和miRNA-146b的表達(dá)水平與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有負(fù)相關(guān)性,即有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miRNA-146a和miRNA-146b表達(dá)水平越低。

        此外,miRNA還參與卵巢癌的化療耐藥過(guò)程。Boren等[13]證實(shí)27個(gè)miRNA與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。Weiner-Gorzel等[14]發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療耐藥與miR-433表達(dá)上調(diào)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a可以通過(guò)促炎細(xì)胞因子干擾胰島素分泌[15],而且誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞程序性死亡的增加[16]。目前研究表明miR-146a/b的抑癌作用與其調(diào)控NF-κB通路的活性有關(guān),轉(zhuǎn)染miR-146a/b的MDAMB-231細(xì)胞中的表達(dá)量明顯下調(diào),其下游基因表達(dá)水平亦下降,這些基因?qū)?xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移功能有調(diào)控作用[17]。

        總之,本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-146a和miR-146b的表達(dá)比癌旁組織呈明顯下調(diào),miR-146a和miR-146b的表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在負(fù)相關(guān),說(shuō)明miR-146a和miR-146b的表達(dá)可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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        Expression of miR-146a and miR-146b in Ovarian Cancer and its Clinical Significance

        LIU Zhi-hui, LIU Ping

        (Second People′s Hospital of Nanyang,Nanyang 473000,China)

        ObjectiveInvestigating the expression of miR-146a and miR-146b in ovarian cancer and adjacent non-cancerous tissuesand its correlation with clinicopathologic characteristics.Methods38 cases of ovarian cancer tissues and and adjacent non-cancerous tissues were collected in our hospital from January 2013 to October 2015.RT-PCR was used to detect the expressions of miR-146a and miR-146bin 38 pairs ovarian cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues, the correlation with clinical pathologic parameters and clinical significance were analyzed also.ResultsThe average expression of miR-146a and miR-146b was significantly down-regulated in ovarian cancer tissues compared with the adjacent non-cancerous tissues(6.74±2.74) VS (7.08±1.70), (6.33±2.14) VS (7.26±2.59), respectively (allP<0.05). There were significantly negative correlation between the expression of miR-146a and miR-146b and lymph node metastasis (allP<0.05).ConclusionmiR-146a and miR-146b may play an important role in the tumorigenesis and tumor progression of ovarian cancer.

        ovarian cancer;miR-146a;miR-146b;clinical stage;lymphnode metastasis

        1672-688X(2016)04-0252-03

        10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.004

        2016-07-12

        南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院,河南南陽(yáng) 473000

        劉志惠(1980-),女,回族,河南南陽(yáng)人,醫(yī)師,從事婦產(chǎn)科臨床、科研工作。

        R737.31

        A

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