任麗平，李先佳，金少舉

槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖及侵襲能力的影響

任麗平，李先佳，金少舉

目的 探討槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖和侵襲能力的影響。方法 用MTT法檢測(cè)不同濃度的槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的影響，Transwll實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲能力的影響，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2和 MMP-9表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度的槐定堿均能明顯抑制capan-1細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 槐定堿能通過(guò)下調(diào)MMPs的表達(dá)水平，有效地抑制capan-1細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞侵襲能力。

胰腺癌；capan-1；槐定堿

胰腺癌起病隱匿、惡性程度高，具有生存率低、病死率高等特點(diǎn)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。該病的治療除傳統(tǒng)的手術(shù)治療外，藥物治療一直是研究熱點(diǎn)。槐定堿是從中藥苦豆子中提取的生物堿之一[1]，具有抗心律失常、保護(hù)心肌、抗菌、抗病毒及鎮(zhèn)痛等作用，對(duì)絨癌、惡性葡萄胎等惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤具有較好的抑制作用[2]，對(duì)癌細(xì)胞具有直接殺傷作用，且毒性較低[3]，但其作用機(jī)制目前并不明確?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloprotein,MMP)為一種常見的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)血管的生成，可為癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移提供必要條件[4]。其中MMP-2、MMP-9為MMP中常見的酶，與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。本研究通過(guò)觀察MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化，探討槐定堿抑制人胰腺癌細(xì)胞株capan-1增殖和侵襲力的可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 capan-1細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代保種。槐定堿為寧夏鹽池縣醫(yī)藥公司提供(批號(hào)：060630，純度>99%)，用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，過(guò)濾除菌4 ℃保存。胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)公司，批號(hào)：140130)，56 ℃滅活30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?；0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：22250-018)；二甲亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(無(wú)錫海碩生物有限公司)，四甲基偶氮唑鹽MTT(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：M2128)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbeco’s modified eagle medium, DMEM)(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：NAE1396)；MMP-2(編號(hào)：MMP200) 和MMP-9(編號(hào)：DMP900)ELISA 試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司)；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。TE2000型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) capan-1細(xì)胞株由漯河醫(yī)專分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代保種，用含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化。

1.3 方法

1.3.1 MTT法測(cè)定槐定堿對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株capan-1細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期capan-1細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至5×104個(gè)·mL-1，取100 μL接種于96孔板，貼壁后24 h去上清，分別加入含10、5、2.5、1.25、0.625、0.308、0.154 g·L-1的槐定堿溶液100 μL，對(duì)照組給予等量培養(yǎng)液，空白對(duì)照組不含細(xì)胞只加等量的培養(yǎng)液；每組3個(gè)復(fù)孔；37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48以及72 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上讀取570 nm處的吸光度(A)值，檢測(cè)重復(fù)4次，計(jì)算抑制率及半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

1.3.2 槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲力的影響 取出-20 ℃保存的Matrigel基質(zhì)膠，4 ℃過(guò)夜，置于冰上，用無(wú)FBS培養(yǎng)基9∶1稀釋基質(zhì)膠。24孔Transwell小室每孔加入20 μL基質(zhì)膠溶液，37 ℃孵育30 min，使Matrigel聚合成膠。將各組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105·mL-1。在Transwell小室下室內(nèi)加入500 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基，置入鋪過(guò)基質(zhì)膠的Transwell小室，上室內(nèi)加入200 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，棄培養(yǎng)基，4%甲醛固定5 min，結(jié)晶紫染色30 min。流水沖洗小室，酒精棉簽小心擦去基質(zhì)膠和細(xì)胞，快速風(fēng)干。倒置小室，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，重復(fù)3次。

1.3.3 槐定堿對(duì)MMP-2及MMP-9的影響 用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，先加稀釋液40 μL到包被反應(yīng)孔中，再加入待檢測(cè)樣品10 μL，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體50 μL(空白孔不加)。37 ℃孵育0.5 h，洗滌。加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B，避光顯色20 min。于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸50 μL。在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔吸光度OD值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMP-2及MMP-9的濃度。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的槐定堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞株capan-1的增長(zhǎng)均具有不同程度的抑制增殖作用，呈時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖1。根據(jù)生長(zhǎng)抑制率采用綜合法計(jì)算24、48和72 h半數(shù)抑制量值，分別為5.93、3.82、2.834 g·L-1。

圖1 槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定槐定堿對(duì)capan-1細(xì)胞侵襲力的影響 用不同濃度1.25、2.5、5 g·L-1的槐定堿干預(yù)48 h后，在顯微鏡(×200)下每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，各組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(25.27±1.53)、(19.42±1.71)和(15.44±2.28)個(gè)，分別與空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(37.32±3.05)個(gè)比較槐定堿組capan-1細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖2。

A：空白對(duì)照組 B、C、D：分別代表槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組圖2 槐定堿作用capan-1細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

2.3 ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞MMP-2及MMP-9表達(dá)量 與空白對(duì)照組比較，槐定堿1.25、2.5、5 g·L-1組capan-1細(xì)胞內(nèi)MMP-2及MMP-9表達(dá)水平較明顯下降(P<0.05)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖3。

A：各組MMP-2表達(dá)量;B：各組MMP-2表達(dá)量。 ①與空白組比較，P<0.05。圖3 ELISA檢測(cè)MMP2及MMP-9含量

3 討論

多項(xiàng)研究表明槐定堿對(duì)惡性腫瘤有治療作用。首先，槐定堿有誘導(dǎo)凋亡作用，李明潺等[6]發(fā)現(xiàn)槐定堿通過(guò)激活caspase-3/8途徑誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，韓靚等[7]研究發(fā)現(xiàn)槐定堿能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞增殖。其次，槐定堿可以抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，趙樹鵬等[8]研究發(fā)現(xiàn)槐定堿通過(guò)NF-κB信號(hào)通路和激活凋亡caspase-3酶聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲、MMP-2的分泌及抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloprotnases, MMPs)是重要的蛋白水解酶，與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。

本研究中不同濃度的槐定堿組對(duì)capan-1細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，不同濃度的槐定堿能明顯抑制capan-1細(xì)胞的增長(zhǎng)，并具有濃度和時(shí)間的依賴性，尤其5 g·L-1濃度抑制效果尤其明顯，提示槐定堿能顯著抑制capan-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。MMP-2和MMP-9均為MMPs中常見基質(zhì)金屬酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞細(xì)胞基底膜的連續(xù)性和完整性，與胰腺癌[10]、肝癌[11]等癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力以及浸潤(rùn)密切相關(guān)。本研究顯示不同濃度的槐定堿加入capan-1細(xì)胞培養(yǎng)液中48 h后，結(jié)果顯示槐定堿能在一定程度下調(diào)MMP-2和MMP-9水平，而且槐定堿水平越高，MMP-2和MMP-9水平越低，上述結(jié)果與槐定堿對(duì)其他腫瘤侵襲的影響研究一致[8]。這也提示槐定堿能有效抑制capan-1細(xì)胞的增殖及侵襲能力，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

總之，槐定堿能有效抑制capan-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力，通過(guò)協(xié)調(diào)MMPs的表達(dá)水平拮抗胰腺癌的侵襲，對(duì)其進(jìn)一步研究，可為胰腺癌的靶向治療提供新的方法。

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Sophoridine Effect on the Proliferation and Invasiveness of Human Pancreatic Cancer Capan-1 Cells Lines

REN Li-ping, LI Xian-jia, JIN Shao-ju

(Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

ObjectiveTo explore the effect of Sophoridine on proliferation and invasiveness of human pancreatic cancer capan-1 cells lines.MethodsMTT was used to detect the effcct of Sophoridine with different concentration on the proliferation of capan-1 cells. Transwll assay detected the effect of Sophoridine on the invasiveness of capan-1 cells, and ELISA assay detected expression level of MMP-2 and MMP-9.ResultsCompared with control group, different concentration of Sophoridine could inhibit growth of capan-1 cells significantly (P<0.05).The expression level of MMP-2 and MMP-9 were down-regulated for the group with the dosage of 1.25, 2.5, 5 g·L-1Sophoridine, respectively (P<0.05).ConclusionSophoridine could decrease MMPs expression level, inhibit cell proliferation of capan-1, and reduce the cell invasiveness of capan-1.

pancreatic cancer；capan-1 cells；Sophoridine

1672-688X(2016)04-0244-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.002

1.河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(16B310004) 2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校2016年度校級(jí)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目(2016-S-LMC-13)

2016-10-07

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河 462002

任麗平(1984-)，女，河南舞陽(yáng)人，講師，從事腫瘤藥理學(xué)研究。

金少舉，男，博士，副教授，Email：37050573@qq.com

R285.5;R735.9

A