蔡陽(yáng)陽(yáng)，何 濤，張 新，袁紅瑛

Smo和Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義

蔡陽(yáng)陽(yáng)1，何 濤1，張 新1，袁紅瑛2

目的 探討Smo和Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2007年至2009年刮宮或手術(shù)切除經(jīng)病理科確診的組織標(biāo)本，分為正常增殖期子宮內(nèi)膜組20例、不典型增生組21例與子宮內(nèi)膜腺癌組58例。采用免疫組化法檢測(cè)Smo和Gli1蛋白的表達(dá)，分析其與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以及兩因子在子宮內(nèi)膜腺癌表達(dá)中的相關(guān)性。并對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌患者的進(jìn)行隨訪和Kaplan-meier生存分析。結(jié)果 Smo蛋白在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生及子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性率分別為5.00%、33.33%和58.62%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，Gli1蛋白的陽(yáng)性率分別是0.00%、28.57%、60.34%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Smo和Gli1的表達(dá)均與子宮內(nèi)膜腺癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、肌層侵潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)；兩因子在子宮內(nèi)膜腺癌表達(dá)中有正相關(guān)性(rs=0.679，P<0.05)。Smo和Gli1表達(dá)陽(yáng)性病例總體生存率均低于陰性病例(均P<0.05)。結(jié)論 Smo及Gli1蛋白可能在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，聯(lián)合檢測(cè)Smo和Gli1蛋白可為診治子宮內(nèi)膜腺癌及預(yù)后提供依據(jù)。

Smo；Gli1；子宮內(nèi)膜癌；免疫組織化學(xué)；生存分析

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma, EAC)是女性生殖道惡性腫瘤之一，其在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)排在女性生殖道惡性腫瘤的首位[1]。其發(fā)病高峰年齡在50～70歲，多發(fā)生在絕經(jīng)后女性，但近年來(lái)年輕女性子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病比例逐年增高[1]。子宮內(nèi)膜癌的篩查方法有限，對(duì)絕經(jīng)后出現(xiàn)異常子宮出血的女性，需要在進(jìn)一步診斷性刮宮后送病理檢驗(yàn)，若有可疑腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的，還需行CT和MRI確定腫瘤浸潤(rùn)的深度和范圍，以確定手術(shù)方式和手術(shù)范圍，術(shù)后可以根據(jù)情況聯(lián)合放療和化療。

參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路主要包括G蛋白耦聯(lián)受體通路、酪氨酸激酶受體通路、Wnt通路、TGF通路、Hh通路、TNF通路等[2]。近年來(lái)對(duì)Hh信號(hào)通路的研究成了熱點(diǎn)。Hh通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-4]，如胰腺癌[5]、基底細(xì)胞癌、前列腺癌[6]、食管癌[7]、結(jié)腸癌[8]、胃癌[9]、乳腺癌[10]等。本實(shí)驗(yàn)探討Hh信號(hào)通路中Smo蛋白和Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 收集材料 收集我院 2007年至2009年刮宮或手術(shù)切除經(jīng)病理科確診子宮組織標(biāo)本，入組者均無(wú)術(shù)前放化療病史。按標(biāo)本組織類型分成3組：正常子宮內(nèi)膜組21例、子宮內(nèi)膜的不典型增生組21例和子宮內(nèi)膜腺癌組58例。應(yīng)用免疫組化SP法(streptavidin peroxidase conjugated method, SP)對(duì)3組不同類型的子宮內(nèi)膜進(jìn)行Smo和Gli1蛋白檢測(cè)。子宮內(nèi)膜腺癌組高分化21例，中分化13例，低分化24例，按 FIGO 2009年臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期26例；其中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例。上述標(biāo)本經(jīng)過(guò)10%福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm厚為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體Smo(bs-2801R)、兔抗人多克隆抗體Gli1(bs-11564R)及SP法免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自福建邁新公司。Smo工作濃度1∶150，Gli1工作濃度1∶150。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 采用免疫組化SP法，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

1.4 結(jié)果判定 Smo蛋白和Gli1蛋白陽(yáng)性染色部位均位于胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆粒或者棕褐色顆粒為陽(yáng)性。高倍鏡下(400倍)分析，按半定量進(jìn)行，以陽(yáng)性細(xì)胞染色的強(qiáng)度及數(shù)量來(lái)綜合評(píng)判。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：A染色的強(qiáng)度：未染色的記0分,淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；B計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)的選取至少10個(gè)高倍視野(400倍)，每個(gè)高倍視野中計(jì)數(shù)完整的腫瘤細(xì)胞100個(gè)，判斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)著色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)分，分別為0～4分，其中<5%為 0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。以AB兩項(xiàng)的乘積作為綜合評(píng)分結(jié)果，結(jié)果評(píng)判：陽(yáng)性表達(dá)≥4分，陰性表達(dá)<4分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，免疫組化半定量結(jié)果轉(zhuǎn)為計(jì)數(shù)資料，比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組變量之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，隨訪資料采用Kaplan-Meier生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smo在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá) Smo蛋白陽(yáng)性染色部位均位于胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆粒或者棕褐色顆粒為陽(yáng)性，見圖1。 Smo在子宮內(nèi)膜癌陽(yáng)性表達(dá)率58.62%(34/58)，子宮內(nèi)膜不典型增生為33.33%(7/21)，正常子宮內(nèi)膜為5.00%， 3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.407，P<0.05)，見表1。

表1 3組Smo陽(yáng)性表達(dá)比較

A.增殖期 B.不典型增生 C.高分化癌 D.中分化癌 E.低分化癌圖1 Smo在各組織的表達(dá)(SP，×200)

2.2 Gli1在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá) Gli1蛋白陽(yáng)性染色部位均位于胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆?；蛘咦睾稚w粒為陽(yáng)性，見圖2。 Gli1在子宮內(nèi)膜癌中陽(yáng)性表達(dá)率為60.34%(35/58)，在不典型增生組織中為28.57%(6/21)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.132，P<0.05)，見表2。兩兩比較：子宮內(nèi)膜癌組與不典型增生組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.235，P=0.013)；子宮內(nèi)膜癌組與正常內(nèi)膜組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.893，P<0.05)；不典型增生組與正常內(nèi)膜組比較，經(jīng)Fisher’s Exact Test 得P=0.021，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 3組Gli1陽(yáng)性表達(dá)比較

A.增殖期 B.不典型增生 C.高分化癌 D.中分化癌 E.低分化癌圖2 Gli1在各組織的表達(dá)(SP，×200)

2.3 Smo和Gli1與EAC臨床生物學(xué)特征 Smo蛋白在高、中、低分化癌中的陽(yáng)性表達(dá)率依次為38.09%、53.84%、79.16%，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.946，P=0.019)，見表3。根據(jù)FIGO(2009)臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.108，P=0.013)；子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤(rùn)≥1/2與肌層浸潤(rùn)<1/2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.525，P=0.019)；入選的58例子宮內(nèi)膜癌手術(shù)標(biāo)本中有30例在手術(shù)中行淋巴結(jié)清掃，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)；而兩個(gè)年齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.079，P=0.778)。Gli1蛋白在高、中、低分化癌中的陽(yáng)性表達(dá)率依次為38.1%、53.8%、83.3%，3組比較。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.874，P=0.007)，見表3。Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜癌與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.508，P=0.011)；子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤(rùn)≥1/2與肌層浸潤(rùn)<1/2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.385，P=0.001)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；兩組年齡之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.191，P=0.662)。

表3 Smo和Gli1蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的臨床生物學(xué)特性的關(guān)系

(續(xù)表)

生物學(xué)特征nSmoGli1陽(yáng)性陽(yáng)性率/%χ2P陽(yáng)性陽(yáng)性率/%χ2P臨床分期 Ⅰ～Ⅱ321340.63 Ⅲ～Ⅳ261973.086.1080.0131443.752076.926.5080.011肌層浸潤(rùn) <1/219736.84 ≥1/2392769.235.5250.019631.582769.237.3850.007淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)21628.57 有9777.800.02523.81888.890.002年齡 <5015960.00 ≥50432455.810.0790.778640.002046.510.1910.662

2.4 Smo蛋白和Gli1蛋白子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)的相關(guān)性 在58例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本中，Smo蛋白和Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中共同陽(yáng)性表達(dá)30例，共同陰性表達(dá)19例，經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.710，P<0.01)，相關(guān)系數(shù)rs=0.679，兩者呈正相關(guān)，見表4。

表4 Smo和Gli1在子宮內(nèi)膜腺癌表達(dá)中的相關(guān)性 例

注：相關(guān)系數(shù)rs=0.679。

2.5 統(tǒng)計(jì)生存分析 對(duì)58例子宮內(nèi)膜腺癌患者從手術(shù)日期開始至2015年9月隨訪結(jié)果，失訪13例，隨訪率是77.6%，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，Smo表達(dá)陽(yáng)性病例總體生存率低于陰性病例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.960，P=0.008)，見圖3；Gli1表達(dá)陽(yáng)性病例總體生存率低于陰性病例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.961，P<0.05)，見圖4。

3 討論

Hh信號(hào)通路的主要成分有：細(xì)胞間的游離Hh配體，細(xì)胞膜上的蛋白Patched(ptch1、ptch2)，細(xì)胞膜上7次跨膜蛋白smoothened(Smo)，細(xì)胞內(nèi)其下游的很多分子：如Fused(Fu)、suppressor：offused[Su(Fu)]、Casein Kinase Iα(CKIα)、蛋白激酶A(protein kinase，PKA)、Costal2(屬于微管相關(guān)蛋白)、glycogen synthase kinase3β(GSK3β)和Glis蛋白中的Gli1、Gli2、Gli3蛋白(屬于鋅指核轉(zhuǎn)錄因子)等[11]。

圖3 Smo蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床預(yù)后的Kaplan-meier分析(P=0.008)

圖4 Gli1蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床預(yù)后的Kaplan-meier分析(P<0.05)

正常生理情況下此信號(hào)通路是處于抑制狀態(tài)，即細(xì)胞間質(zhì)Hh信號(hào)蛋白是缺失的，不能與膜蛋白Patched結(jié)合。此時(shí)膜蛋白Patched與細(xì)胞膜上的Smo蛋白則形成復(fù)合物，阻止了Smo分子轉(zhuǎn)位，即抑制Smo蛋白的活性，阻礙它在細(xì)胞表面上的定位，阻止其往下游的細(xì)胞內(nèi)部傳遞信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)Hh信號(hào)蛋白存在時(shí)，Hh蛋白與受體Patched發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致蛋白Patched不能與Smo蛋白形成復(fù)合物，即解除了Patched蛋白對(duì)Smo蛋白的抑制作用。Smo蛋白在細(xì)胞膜上的定位發(fā)生改變，即蛋白Smo分子羧基末端發(fā)生多個(gè)絲/蘇氨酸殘基的磷酸化，信號(hào)不再被Patched蛋白抑制， Smo蛋白激活。信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)部傳遞，細(xì)胞內(nèi)微管上的復(fù)合物(由COS2驅(qū)動(dòng)蛋白樣分子和絲/蘇氨酸激酶Fus、Sufu聚集結(jié)合而成)發(fā)生解離，下游通路被啟動(dòng)，之后信號(hào)傳達(dá)給細(xì)胞內(nèi)部的核轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白，激活的Gli1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中，激活靶基因，進(jìn)而促使目的基因的表達(dá)，最后調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及分化[12]。腫瘤發(fā)病機(jī)制中，Hh信號(hào)通路異常激活有兩種方式：一是配體依賴性，即由于配體Hh蛋白發(fā)生的突變引起內(nèi)源性Hh信號(hào)表達(dá)，與Patched蛋白受體相結(jié)合，解除對(duì)Smo蛋白的抑制，進(jìn)而導(dǎo)致下游分子信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)失去控制，激活靶基因，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；二是配體非依賴性，即Patched、Smo及Glis等基因突變發(fā)生，引起Hh通路異常激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

本研究結(jié)果提示，Smo和Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)都高于正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜不典型增生，并且二者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)與分化程度(高、中、低)、臨床分期、肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。Smo和Gli1蛋白在低分化子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)高于高分化和中分化，臨床分期越晚其表達(dá)越高，浸潤(rùn)越深表達(dá)也越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，而二者均與患者年齡無(wú)關(guān)。并且，Smo和Gli1在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，可能存在協(xié)同作用。隨訪生存分析顯示Smo和Gli1蛋白表達(dá)陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌總體存活率低于陰性表達(dá)。

綜上所述，Smo和Gli1蛋白的異常表達(dá)可能參與并共同促進(jìn)了子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展，并且與子宮內(nèi)膜腺癌預(yù)后有關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)Smo和Gli1蛋白可能成為臨床診治子宮內(nèi)膜腺癌及預(yù)后的重要參考依據(jù)。

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Expression of Smo and Gli1 in Endometrial Adenocarcinoma and Its Correlation with the Clinicopathological Characteristics

CAI Yang-yang1, HE Tao1, ZHANG Xin1, YUAN Hong-ying2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Medical College, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo discuss the expression of Smo and Gli1 protein in endometrial adenocarcinoma(EAC) tissue and its correlation with EAC clinicopathological characeristics.MethodsParaffin-embedded specimens were collected from the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, and divided into three groups: normal proliferative stage of endometrium group(20 cases), atypical hyperplasia of endometrium (AEH) group(21 cases) and EAC group(58 cases). The expressions of Smo and Gli1 protein in the tissues of the three groups were detected by immunohistochemical method, and their relationship with biological characteristics of EAC and the correlation of the two factors in EAC were analyzed. Follow-up visits and Kaplan-meier survival analysis were performed in the EAC patients.ResultsThe positive expression rates of Smo protein in normal endometrial tissue, AEH and EAC were 5%, 33.34% and 58.64%, respectively,and the difference in the three groups had statistical significance (P<0.05). Meanwhile, the expression of Gli1 protein in normal endometrial tissue, AEH and EAC tissue were 0%, 28.57% and 60.34%, respectively, and that had statistically significant difference (P<0.05). The positive expressions of Smo and Gli1 were related to histological grade, clinical stage, muscular layer infiltration and lymphatic metastasis of EAC tissue (P<0.05), but they were not related to age (P>0.05). The expressions of two factors showed a positive correlation in EAC (rs=0.679,

P<0.05).ConclusionSmo and Gli1 might play an important role in carcinogenesis and development of EAC.Smo combined with Gli1 detection might provide a basis for the diagnosis,treatment and prognosis of EAC.

Smo；Gli1；endometrial adenocarcinoma；immunohistochemical method；survival analysis

1672-688X(2016)04-0247-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.003

2016-03-14

1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，河南洛陽(yáng) 471000 2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000

蔡陽(yáng)陽(yáng)(1989-)，女，河南新鄉(xiāng)人，醫(yī)師，從事婦科腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究工作。

袁紅瑛，女，教授，E-mail：374663945@qq.com

R737.33

A