蔡陽陽，何 濤，張 新，袁紅瑛

Smo和Gli1蛋白在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義

蔡陽陽1，何 濤1，張 新1，袁紅瑛2

目的 探討Smo和Gli1蛋白在子宮內膜癌組織中的表達及其臨床意義。方法 收集河南科技大學第一附屬醫(yī)院 2007年至2009年刮宮或手術切除經病理科確診的組織標本，分為正常增殖期子宮內膜組20例、不典型增生組21例與子宮內膜腺癌組58例。采用免疫組化法檢測Smo和Gli1蛋白的表達，分析其與子宮內膜腺癌臨床病理特征的關系，以及兩因子在子宮內膜腺癌表達中的相關性。并對子宮內膜腺癌患者的進行隨訪和Kaplan-meier生存分析。結果 Smo蛋白在正常子宮內膜、不典型增生及子宮內膜癌中的陽性率分別為5.00%、33.33%和58.62%，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時，Gli1蛋白的陽性率分別是0.00%、28.57%、60.34%，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Smo和Gli1的表達均與子宮內膜腺癌的組織學分級、臨床分期、肌層侵潤、淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與年齡無關(P>0.05)；兩因子在子宮內膜腺癌表達中有正相關性(rs=0.679，P<0.05)。Smo和Gli1表達陽性病例總體生存率均低于陰性病例(均P<0.05)。結論 Smo及Gli1蛋白可能在子宮內膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，聯(lián)合檢測Smo和Gli1蛋白可為診治子宮內膜腺癌及預后提供依據。

Smo；Gli1；子宮內膜癌；免疫組織化學；生存分析

子宮內膜癌(endometrial carcinoma, EAC)是女性生殖道惡性腫瘤之一，其在發(fā)達國家已經排在女性生殖道惡性腫瘤的首位[1]。其發(fā)病高峰年齡在50～70歲，多發(fā)生在絕經后女性，但近年來年輕女性子宮內膜腺癌的發(fā)病比例逐年增高[1]。子宮內膜癌的篩查方法有限，對絕經后出現(xiàn)異常子宮出血的女性，需要在進一步診斷性刮宮后送病理檢驗，若有可疑腫瘤浸潤和轉移的，還需行CT和MRI確定腫瘤浸潤的深度和范圍，以確定手術方式和手術范圍，術后可以根據情況聯(lián)合放療和化療。

參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路主要包括G蛋白耦聯(lián)受體通路、酪氨酸激酶受體通路、Wnt通路、TGF通路、Hh通路、TNF通路等[2]。近年來對Hh信號通路的研究成了熱點。Hh通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-4]，如胰腺癌[5]、基底細胞癌、前列腺癌[6]、食管癌[7]、結腸癌[8]、胃癌[9]、乳腺癌[10]等。本實驗探討Hh信號通路中Smo蛋白和Gli1蛋白在子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 收集材料 收集我院 2007年至2009年刮宮或手術切除經病理科確診子宮組織標本，入組者均無術前放化療病史。按標本組織類型分成3組：正常子宮內膜組21例、子宮內膜的不典型增生組21例和子宮內膜腺癌組58例。應用免疫組化SP法(streptavidin peroxidase conjugated method, SP)對3組不同類型的子宮內膜進行Smo和Gli1蛋白檢測。子宮內膜腺癌組高分化21例，中分化13例，低分化24例，按 FIGO 2009年臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期26例；其中發(fā)生淋巴結轉移9例。上述標本經過10%福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm厚為標準。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體Smo(bs-2801R)、兔抗人多克隆抗體Gli1(bs-11564R)及SP法免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自福建邁新公司。Smo工作濃度1∶150，Gli1工作濃度1∶150。

1.3 實驗步驟 采用免疫組化SP法，實驗步驟按照試劑盒說明書進行操作，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復，DAB顯色，蘇木素復染。

1.4 結果判定 Smo蛋白和Gli1蛋白陽性染色部位均位于胞質。細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆?；蛘咦睾稚w粒為陽性。高倍鏡下(400倍)分析，按半定量進行，以陽性細胞染色的強度及數量來綜合評判。評分標準如下：A染色的強度：未染色的記0分,淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；B計數的標準：隨機的選取至少10個高倍視野(400倍)，每個高倍視野中計數完整的腫瘤細胞100個，判斷標準：依據著色細胞的百分數進行計分，分別為0～4分，其中<5%為 0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。以AB兩項的乘積作為綜合評分結果，結果評判：陽性表達≥4分，陰性表達<4分。

1.5 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件進行數據分析，免疫組化半定量結果轉為計數資料，比較采用χ2檢驗，兩組變量之間的關系采用Spearman相關分析，隨訪資料采用Kaplan-Meier生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Smo在子宮內膜組織的表達 Smo蛋白陽性染色部位均位于胞質，細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆?；蛘咦睾稚w粒為陽性，見圖1。 Smo在子宮內膜癌陽性表達率58.62%(34/58)，子宮內膜不典型增生為33.33%(7/21)，正常子宮內膜為5.00%， 3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.407，P<0.05)，見表1。

表1 3組Smo陽性表達比較

A.增殖期 B.不典型增生 C.高分化癌 D.中分化癌 E.低分化癌圖1 Smo在各組織的表達(SP，×200)

2.2 Gli1在子宮內膜組織的表達 Gli1蛋白陽性染色部位均位于胞質，細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒、黃色的顆?；蛘咦睾稚w粒為陽性，見圖2。 Gli1在子宮內膜癌中陽性表達率為60.34%(35/58)，在不典型增生組織中為28.57%(6/21)。3組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=24.132，P<0.05)，見表2。兩兩比較：子宮內膜癌組與不典型增生組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.235，P=0.013)；子宮內膜癌組與正常內膜組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.893，P<0.05)；不典型增生組與正常內膜組比較，經Fisher’s Exact Test 得P=0.021，差異具有統(tǒng)計學意義。

表2 3組Gli1陽性表達比較

A.增殖期 B.不典型增生 C.高分化癌 D.中分化癌 E.低分化癌圖2 Gli1在各組織的表達(SP，×200)

2.3 Smo和Gli1與EAC臨床生物學特征 Smo蛋白在高、中、低分化癌中的陽性表達率依次為38.09%、53.84%、79.16%，三者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.946，P=0.019)，見表3。根據FIGO(2009)臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期子宮內膜癌與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.108，P=0.013)；子宮內膜癌肌層浸潤≥1/2與肌層浸潤<1/2比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.525，P=0.019)；入選的58例子宮內膜癌手術標本中有30例在手術中行淋巴結清掃，有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)；而兩個年齡組比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.079，P=0.778)。Gli1蛋白在高、中、低分化癌中的陽性表達率依次為38.1%、53.8%、83.3%，3組比較。差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.874，P=0.007)，見表3。Ⅰ～Ⅱ期子宮內膜癌與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.508，P=0.011)；子宮內膜癌肌層浸潤≥1/2與肌層浸潤<1/2比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.385，P=0.001)；有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)；兩組年齡之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.191，P=0.662)。

表3 Smo和Gli1蛋白的表達與子宮內膜腺癌的臨床生物學特性的關系

(續(xù)表)

生物學特征nSmoGli1陽性陽性率/%χ2P陽性陽性率/%χ2P臨床分期 Ⅰ～Ⅱ321340.63 Ⅲ～Ⅳ261973.086.1080.0131443.752076.926.5080.011肌層浸潤 <1/219736.84 ≥1/2392769.235.5250.019631.582769.237.3850.007淋巴結轉移 無21628.57 有9777.800.02523.81888.890.002年齡 <5015960.00 ≥50432455.810.0790.778640.002046.510.1910.662

2.4 Smo蛋白和Gli1蛋白子宮內膜腺癌中表達的相關性 在58例子宮內膜癌組織標本中，Smo蛋白和Gli1蛋白在子宮內膜癌組織中共同陽性表達30例，共同陰性表達19例，經SPSS 16.0統(tǒng)計軟件采用Spearman等級相關分析，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=26.710，P<0.01)，相關系數rs=0.679，兩者呈正相關，見表4。

表4 Smo和Gli1在子宮內膜腺癌表達中的相關性 例

注：相關系數rs=0.679。

2.5 統(tǒng)計生存分析 對58例子宮內膜腺癌患者從手術日期開始至2015年9月隨訪結果，失訪13例，隨訪率是77.6%，經Log-rank檢驗，Smo表達陽性病例總體生存率低于陰性病例，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.960，P=0.008)，見圖3；Gli1表達陽性病例總體生存率低于陰性病例，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=20.961，P<0.05)，見圖4。

3 討論

Hh信號通路的主要成分有：細胞間的游離Hh配體，細胞膜上的蛋白Patched(ptch1、ptch2)，細胞膜上7次跨膜蛋白smoothened(Smo)，細胞內其下游的很多分子：如Fused(Fu)、suppressor：offused[Su(Fu)]、Casein Kinase Iα(CKIα)、蛋白激酶A(protein kinase，PKA)、Costal2(屬于微管相關蛋白)、glycogen synthase kinase3β(GSK3β)和Glis蛋白中的Gli1、Gli2、Gli3蛋白(屬于鋅指核轉錄因子)等[11]。

圖3 Smo蛋白表達與子宮內膜腺癌臨床預后的Kaplan-meier分析(P=0.008)

圖4 Gli1蛋白表達與子宮內膜腺癌臨床預后的Kaplan-meier分析(P<0.05)

正常生理情況下此信號通路是處于抑制狀態(tài)，即細胞間質Hh信號蛋白是缺失的，不能與膜蛋白Patched結合。此時膜蛋白Patched與細胞膜上的Smo蛋白則形成復合物，阻止了Smo分子轉位，即抑制Smo蛋白的活性，阻礙它在細胞表面上的定位，阻止其往下游的細胞內部傳遞信號。當細胞間質內Hh信號蛋白存在時，Hh蛋白與受體Patched發(fā)生結合，導致蛋白Patched不能與Smo蛋白形成復合物，即解除了Patched蛋白對Smo蛋白的抑制作用。Smo蛋白在細胞膜上的定位發(fā)生改變，即蛋白Smo分子羧基末端發(fā)生多個絲/蘇氨酸殘基的磷酸化，信號不再被Patched蛋白抑制， Smo蛋白激活。信號向細胞內部傳遞，細胞內微管上的復合物(由COS2驅動蛋白樣分子和絲/蘇氨酸激酶Fus、Sufu聚集結合而成)發(fā)生解離，下游通路被啟動，之后信號傳達給細胞內部的核轉錄因子Gli1蛋白，激活的Gli1蛋白進入細胞核中，激活靶基因，進而促使目的基因的表達，最后調節(jié)細胞的生長、增殖以及分化[12]。腫瘤發(fā)病機制中，Hh信號通路異常激活有兩種方式：一是配體依賴性，即由于配體Hh蛋白發(fā)生的突變引起內源性Hh信號表達，與Patched蛋白受體相結合，解除對Smo蛋白的抑制，進而導致下游分子信號傳遞調節(jié)失去控制，激活靶基因，最終導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；二是配體非依賴性，即Patched、Smo及Glis等基因突變發(fā)生，引起Hh通路異常激活，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

本研究結果提示，Smo和Gli1蛋白在子宮內膜腺癌中的表達都高于正常子宮內膜及子宮內膜不典型增生，并且二者在子宮內膜腺癌中的表達與分化程度(高、中、低)、臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉移情況有關。Smo和Gli1蛋白在低分化子宮內膜腺癌中的表達高于高分化和中分化，臨床分期越晚其表達越高，浸潤越深表達也越高，有淋巴結轉移的高于無淋巴結轉移的，而二者均與患者年齡無關。并且，Smo和Gli1在子宮內膜腺癌中的表達呈正相關，可能存在協(xié)同作用。隨訪生存分析顯示Smo和Gli1蛋白表達陽性的子宮內膜癌總體存活率低于陰性表達。

綜上所述，Smo和Gli1蛋白的異常表達可能參與并共同促進了子宮內膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展，并且與子宮內膜腺癌預后有關。因此，聯(lián)合檢測Smo和Gli1蛋白可能成為臨床診治子宮內膜腺癌及預后的重要參考依據。

[1] 陳樂真.婦產科診斷病理學[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2010:204-212.

[2]Tetsuroh S,Tetsuya M,Masaru K.Frequent up-regulation of WNT5A mRNA in primary gastric cancer[J].Int J Mol Med,2002,9(5):515-519.

[3]Michalis A,Morgane L,Harris WA,et al.A general role of hedgehog in the regulation of proliferation[J].Cell Cycle,2007,6(2):156-159.

[4]Vestergaard J,Bak M,Larsen LA.The Hedgehog signaling pa-thway in cancer[J].Prog Mol Subcell Biol,2005,40(3):1-28.

[5]Liu MS,Yang PY,Yeh TS.Sonic hedgehog signaling pathway in pancreatic cystic neoplasms and ductal adenocarcinoma[J].Pancreas,2007,34(3):340-346.

[6]Walsh PC.Hedgehog signalling in prostate regeneration,neoplasia and metastasis[J].J Urol,2004,431(7009):707-712.

[7]Mori Y,Okumura T,Tsunoda S,et al.Gli-1 expression is associated with lymph node metastasis and tumor progression in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncology,2006, 70(5):378-389.

[8]Richard D, Stéphane M,Pascal P,et al.Sonic Hedgehog-dependent proliferation in a series of patients with colorectal cancer[J].Surgery,2006,139(5):665-670.

[9]Lee SY,Han HS,Lee KY,et al.Sonic Hedgehog expression in gastric cancer and gastric adenoma[J].Oncol Rep,2007,17(5):1051-1055.

[10]黃海林,胡志前,王為民,等. Hedgehog信號傳導通路在乳腺癌中表達增強[J].基礎醫(yī)學與臨床,2009,29(5):522-526.

[11]Rubin LL,Sauvage FJD.Targeting the Hedgehog pathway in cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2010, 2(4):1026-1033.

[12]Beachy PA,Karhadkar SS,Berman DM.Tissue repair and stem cell renewal in carcinogenesis[J].Nature,2004,432(7015):324-331.

Expression of Smo and Gli1 in Endometrial Adenocarcinoma and Its Correlation with the Clinicopathological Characteristics

CAI Yang-yang1, HE Tao1, ZHANG Xin1, YUAN Hong-ying2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Medical College, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo discuss the expression of Smo and Gli1 protein in endometrial adenocarcinoma(EAC) tissue and its correlation with EAC clinicopathological characeristics.MethodsParaffin-embedded specimens were collected from the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, and divided into three groups: normal proliferative stage of endometrium group(20 cases), atypical hyperplasia of endometrium (AEH) group(21 cases) and EAC group(58 cases). The expressions of Smo and Gli1 protein in the tissues of the three groups were detected by immunohistochemical method, and their relationship with biological characteristics of EAC and the correlation of the two factors in EAC were analyzed. Follow-up visits and Kaplan-meier survival analysis were performed in the EAC patients.ResultsThe positive expression rates of Smo protein in normal endometrial tissue, AEH and EAC were 5%, 33.34% and 58.64%, respectively,and the difference in the three groups had statistical significance (P<0.05). Meanwhile, the expression of Gli1 protein in normal endometrial tissue, AEH and EAC tissue were 0%, 28.57% and 60.34%, respectively, and that had statistically significant difference (P<0.05). The positive expressions of Smo and Gli1 were related to histological grade, clinical stage, muscular layer infiltration and lymphatic metastasis of EAC tissue (P<0.05), but they were not related to age (P>0.05). The expressions of two factors showed a positive correlation in EAC (rs=0.679,

P<0.05).ConclusionSmo and Gli1 might play an important role in carcinogenesis and development of EAC.Smo combined with Gli1 detection might provide a basis for the diagnosis,treatment and prognosis of EAC.

Smo；Gli1；endometrial adenocarcinoma；immunohistochemical method；survival analysis

1672-688X(2016)04-0247-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.003

2016-03-14

1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院婦科，河南洛陽 471000 2.河南科技大學醫(yī)學院，河南洛陽 471000

蔡陽陽(1989-)，女，河南新鄉(xiāng)人，醫(yī)師，從事婦科腫瘤的基礎與臨床研究工作。

袁紅瑛，女，教授，E-mail：374663945@qq.com

R737.33

A