韓翠翠

(江蘇省南京市江寧高級(jí)中學(xué) 211100)

高中階段學(xué)生所學(xué)的微生物的計(jì)數(shù)方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法，高考題中經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)這兩種方法的考核，如2015年高考江蘇卷第3題、新課標(biāo)I卷第39題和四川卷第3題。然而在解題中，學(xué)生常常會(huì)對(duì)這兩種方法的實(shí)驗(yàn)原理和計(jì)數(shù)搞混淆?，F(xiàn)將這兩種方法進(jìn)行比較，并輔以例題進(jìn)行解析，以便學(xué)生理解應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板(也叫做血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。

血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。但是，不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組成。計(jì)數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。

例1 (2015江蘇高考卷·13) 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的重要工具，下列敘述正確的是

A．每塊血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的正中央有1 個(gè)計(jì)數(shù)室

B．計(jì)數(shù)室的容積為1mm×1mm×0. 1mm

C．蓋蓋玻片之前,應(yīng)用吸管直接向計(jì)數(shù)室滴加樣液

D．計(jì)數(shù)時(shí),不應(yīng)統(tǒng)計(jì)壓在小方格角上的細(xì)胞

解析：每塊血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的正中央有2個(gè)計(jì)數(shù)室，A錯(cuò)誤；每個(gè)計(jì)數(shù)室的容積有1mm×1mm×0.1mm，B正確；向血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中滴加樣液前應(yīng)先蓋上蓋玻片，讓樣液自行滲入計(jì)數(shù)室，若先滴加樣液，統(tǒng)計(jì)結(jié)果會(huì)偏大，C錯(cuò)誤；計(jì)數(shù)時(shí)，需統(tǒng)計(jì)小方格內(nèi)以及小方格相鄰兩邊及其頂角的細(xì)胞，D錯(cuò)誤。答案：B。

1.2 稀釋涂布平板法 稀釋涂布平板法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使之成單個(gè)細(xì)胞存在(否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞)，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。該法一般用于某些成品檢定(如殺蟲菌劑等)、生物制品檢驗(yàn)、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗(yàn)。

2 計(jì)數(shù)方法

2.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)方法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法要用到血球計(jì)數(shù)板，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。計(jì)數(shù)時(shí)，如使用規(guī)格為16×25型的血球計(jì)數(shù)板，則在計(jì)數(shù)室內(nèi)選4個(gè)中方格(左上、右上、左下、右下4個(gè)角)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，若使用規(guī)格為25×16型的血球計(jì)數(shù)板，則在計(jì)數(shù)室內(nèi)選5個(gè)中方格(4個(gè)角和中央)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于位于格線上的菌體，一般只統(tǒng)計(jì)兩條格線上的菌體，按照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則計(jì)數(shù)。分別記錄所選中方格中的菌體數(shù)，再算出每個(gè)小方格內(nèi)菌體數(shù)的平均值，乘以400，就能得出一個(gè)大方格中菌體的總數(shù)，然后換算出1mL懸液中菌體總數(shù)。(已知：1mL=10mm×10mm×10mm= 1000mm3； 0.1mm3=10-4mL；1mL懸液中待測菌體總數(shù)=1個(gè)小方格中菌體平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù))。

例2 在“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化”的實(shí)驗(yàn)中，將酵母菌培養(yǎng)液稀釋103倍后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm)進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察圖1的視野。有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是

圖1 顯微鏡下視野

A．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先在計(jì)數(shù)室上方加蓋玻片，再滴加少量樣液

B．計(jì)數(shù)同一樣品時(shí)，可對(duì)同一計(jì)數(shù)板上的兩個(gè)計(jì)數(shù)室進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值

C．滴加培養(yǎng)液后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，以防止酵母菌沉降到計(jì)數(shù)室底部

D．若僅依據(jù)圖示結(jié)果，可以估算培養(yǎng)液中酵母菌密度為3.5×109個(gè)/mL

解析：血球計(jì)數(shù)板使用時(shí)應(yīng)該先蓋蓋玻片，再滴加樣液，所以A正確。一塊血球計(jì)數(shù)板上有兩個(gè)計(jì)數(shù)室，可以對(duì)同一計(jì)數(shù)板上的兩個(gè)計(jì)數(shù)室進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值，所以B正確。滴加培養(yǎng)液后，要等酵母菌沉降到計(jì)數(shù)室底部再計(jì)數(shù)，不應(yīng)立即計(jì)數(shù)，所以C錯(cuò)誤。若僅依據(jù)圖示結(jié)果，可以看出一個(gè)中方格有14個(gè)酵母菌，其含有16個(gè)小方格，則一個(gè)小方格含酵母菌平均數(shù)為0.875個(gè)，則該培養(yǎng)液酵母菌密度為0.875×400×104×103=3.5×109個(gè)/mL。答案：C。

2.2 稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)方法 該法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在 30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(每克土壤樣品的細(xì)菌數(shù)=某一稀釋度幾次重復(fù)培養(yǎng)后的菌落平均數(shù)/涂布所用的稀釋液的體積×稀釋倍數(shù))。

例3 某同學(xué)計(jì)劃統(tǒng)計(jì)食醋中該發(fā)酵菌的總數(shù)，他選用10-4、10-5、10-6稀釋液進(jìn)行涂布，每種稀釋液都設(shè)置了3個(gè)培養(yǎng)皿。從設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的角度看，還應(yīng)設(shè)置一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)是________。該同學(xué)在稀釋倍數(shù)為10-4的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值40.4，則每毫升樣品中的菌體數(shù)________個(gè)(涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積0.2mL)。

解析：生物學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的原則是對(duì)照原則，因此還應(yīng)設(shè)置一組不接種的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以檢測培養(yǎng)基滅菌是否徹底。每克樣品中菌體個(gè)數(shù)=(40.4/0.2)×104=2.02×106。答案：一組不接種的空白培養(yǎng)基 2.02×106。

3 計(jì)數(shù)結(jié)果與待測樣品中實(shí)際含菌數(shù)量比較

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌，因此計(jì)數(shù)結(jié)果與待測樣品中實(shí)際含菌數(shù)量相比往往偏高。

為了避免把死菌計(jì)數(shù)在內(nèi)，可以對(duì)待測菌體染色，如“觀察酵母菌的種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化”實(shí)驗(yàn)，用臺(tái)盼藍(lán)染色，被染成藍(lán)色的，為死菌。反之，為活菌。

稀釋涂布平板法常用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，原因是樣品一般不易完全分散成單個(gè)個(gè)體，而且當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)活細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。

例4 (2015年新課標(biāo)I·39)已知微生物A可以產(chǎn)生油脂，微生物B可以產(chǎn)生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生產(chǎn)。回答有關(guān)問題：

(1)顯微觀察時(shí)，微生物A菌體中的油脂通常可用于________染色。微生物A產(chǎn)生的油脂不易揮發(fā)，可選用________(填“萃取法”或“水蒸氣蒸餾法”)從菌體中提取。

(2)為了從自然界中獲得能產(chǎn)生脂肪酶的微生物B的單菌落，可從含有油料作物種子腐爛物的土壤中取樣，并應(yīng)選用以________為碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

(3)若要測定培養(yǎng)液中微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用________直接計(jì)數(shù)；若要測定其活菌數(shù)量，可選用________法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(4)為了確定微生物B產(chǎn)生的脂肪酶的最適溫度，某同學(xué)測得相同時(shí)間內(nèi)，在35℃、40℃、45℃溫度下降解10g油脂所需酶量依次為4mg、1mg、6mg，則上述三個(gè)溫度中，________℃條件下該酶活力最小。為了進(jìn)一步確定該酶的最適溫度，應(yīng)圍繞________℃設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

解析：(1)油脂可被蘇丹III染液或者蘇丹IV染液染成橘黃色或紅色。由于不易揮發(fā)，故采用萃取法。(2)脂肪酶的微生物B可以分解脂肪，故可以以脂肪為碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，不產(chǎn)生脂肪酶的微生物無法生存。(3)微生物B的菌體數(shù)，可在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)，活菌用稀釋涂布平板法。(4)45℃降解10g油脂所需酶量最大，故酶活性最??；40℃溫度下降解10g油脂所需酶量最小，故酶活性最大，圍繞40℃溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。答案：(1)蘇丹III(或者蘇丹IV) 萃取法 (2)油脂 (3)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 稀釋涂布平板 (4)45 40。