黃海燕，魏佳莉

(海南省人民醫(yī)院：1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.腎內(nèi)科，?？?570100)

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醛固酮誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞膠原Ⅰ、Ⅲ表達(dá)的研究*

黃海燕1，魏佳莉2△

(海南省人民醫(yī)院：1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.腎內(nèi)科，?？?570100)

目的探討Rho激酶對(duì)醛固酮(ALD)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞膠原Ⅰ、Ⅲ(COL Ⅰ、Ⅲ)表達(dá)的影響。方法將人腎小管上皮細(xì)胞HK-2培養(yǎng)于含15%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中,ALD受體拮抗劑依普利酮(10 μmol/L)和Rho激酶抑制劑Y27632(1 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min后，100 nmol/L ALD作用HK-2細(xì)胞24 h，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中COLⅠ、Ⅲ mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶蛋白表達(dá)水平。結(jié)果ALD可上調(diào)HK-2細(xì)胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達(dá)，并增加培養(yǎng)上清液中Rho激酶、COL Ⅰ、Ⅲ蛋白表達(dá)水平，Rho激酶抑制劑Y27632及ALD受體拮抗劑依普利酮可拮抗上述效應(yīng)。結(jié)論ALD可活化HK-2細(xì)胞Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路，并通過(guò)Rho激酶誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞COL Ⅰ、Ⅲ的表達(dá)而加速腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

醛固酮；膠原Ⅰ；膠原Ⅲ；Rho激酶；人近端腎小管上皮細(xì)胞；腎小管間質(zhì)纖維化

腎小管間質(zhì)纖維化是衡量慢性腎臟疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)之一，是各種腎臟疾病慢性進(jìn)展，最終致慢性腎衰竭的共同機(jī)制[1]。腎間質(zhì)纖維化的本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度合成而致ECM的異常沉積[2]。近期研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)致纖維化的細(xì)胞因子及ECM的表達(dá)，是膠原合成的強(qiáng)烈刺激劑[3]。但具體機(jī)制仍未完全明確。Rho三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate，GTP)酶家族是Ras超家族中的一員，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞分子，在真核細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著分子開(kāi)關(guān)作用。目前發(fā)現(xiàn)該家族包括RhoA、RhoB、RhoC等在內(nèi)的15種成員，其中Rho激酶是RhoA的下游效應(yīng)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約160×103，是一個(gè)絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，在細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞轉(zhuǎn)型等過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[4-7]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察ALD對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞Rho激酶活性的影響，探討Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與ALD誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞膠原Ⅰ(collagen Ⅰ，COL Ⅰ)、膠原Ⅰ(collagen Ⅲ，COL Ⅲ)表達(dá)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮HK-2細(xì)胞購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，來(lái)源于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。ALD(eplerenone,EPL,美國(guó)Amersco公司)，依普利酮(eplerenone,EPL,美國(guó)Sigma公司)，Rho激酶抑制劑Y27632(以下簡(jiǎn)稱(chēng)Y27632，美國(guó)Sigma公司)，Trizol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，COL Ⅰ、COL Ⅲ、Rho激酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海勁馬公司)，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清培養(yǎng)液同步化24 h。EPL(10 μmol/L)和Y27632(1 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min后，100 nmol/L ALD作用于HK-2細(xì)胞24 h，作為ALD-EPL組與ALD-Y27632組。另外以未處理HK-2細(xì)胞作為對(duì)照組，100 mmol/L ALD刺激HK-2細(xì)胞作為ALD組。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表達(dá)Trizol提取細(xì)胞總RNA。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，COL Ⅰ(142 bp): 正義5′-GTG GTG AGA CTG GTC CTG CTG-3′，反義5′-AAG CCA CGG TGA CCC TTT ATG-3′；COLⅢ(193 bp)：正義5′-GCC TCC CAG AAC ATT ACA TAC C-3′，反義5′-CTG TCT TGC TCC ATT CAC CAG-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，145 bp)：正義5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TG-3′，反義5′-GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT-3′。引物由上海invitrogen公司合成。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；然后94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；再于72 ℃延伸5 min。計(jì)算目的基因與內(nèi)參GAPDH的比值，即得目的基因mRNA的表達(dá)量。

1.2.3ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表達(dá)收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2　結(jié)　　果

2.1ALD對(duì)HK-2細(xì)胞Rho激酶蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中表達(dá)一定含量的Rho激酶蛋白[(51.29±2.74)pg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激細(xì)胞24 h后(ALD組)，培養(yǎng)上清液中Rho激酶蛋白表達(dá)[(74.71±2.61)pg/mL]較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與ALD組比較，ALE-EPL組[(39.51±1.99)pg/mL]和ALD-Y27632組[(48.79±0.45)pg/mL]Rho激酶蛋白表達(dá)均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明EPL和Y27632均可逆轉(zhuǎn)ALD的上述效應(yīng)。見(jiàn)圖1。

*：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與ALD組比較。

圖1ALD對(duì)HK-2細(xì)胞Rho激酶蛋白表達(dá)的影響

2.2ALD對(duì)HK-2細(xì)胞COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)的影響實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組HK-2細(xì)胞中有少量COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)，100 nmol/L的ALD作用HK-2細(xì)胞24 h后(ALD組)，與對(duì)照組相比，COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ALD組相比，ALD-EPL組COLⅠ、Ⅲ mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632組COLⅠ、Ⅲ mRNA表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P=0.001)，表明EPL和Y27632均可明顯抑制ALD所誘導(dǎo)的COLⅠ、Ⅲ mRNA表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.3ALD對(duì)HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液COLⅠ、Ⅲ 蛋白含量的影響對(duì)照組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有一定含量的COLⅠ、Ⅲ 蛋白表達(dá)[(5.02±0.77)、(3.95±0.20)μg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激細(xì)胞24 h后(ALD組)，培養(yǎng)上清液中COLⅠ[(8.63±0.83)μg/mL，P<0.01]、COLⅢ蛋白[(6.0±0.32)μg/mL,P=0.001]表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯增加。與ALD組相比，ALD-EPL組COLⅠA1[(3.70±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(3.66±0.20)μg/mL]表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632組COLⅠA1[(2.19±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(1.36±0.18)μg/mL]表達(dá)水平均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，表明EPL和Y27632均可明顯抑制ALD所誘導(dǎo)的COLⅠ、Ⅲ 蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖3。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，△：P<0.001，▲：P=0.001，與ALD組比較。

圖2ALD對(duì)HK-2細(xì)胞COLⅠ、Ⅲ mRNA表達(dá)的影響

*：P<0.01，△：P=0.001，與對(duì)照組比較；#：P=0.001，▲：P<0.001，與ALD組比較。

圖3ALD對(duì)HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液COLⅠ、Ⅲ蛋白含量的影響

3　討　　論

腎小管間質(zhì)纖維化是衡量慢性腎臟疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)之一，是各種腎臟疾病慢性進(jìn)展，最終致慢性腎衰竭的共同機(jī)制[8]。近年來(lái)大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，在各種腎臟疾病中，腎小管間質(zhì)的病變程度是反映腎功能減退嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。因此,對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，以及其防治的研究越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的重視。目前,盡管采用了多種干預(yù)治療措施，仍無(wú)法有效延緩大多數(shù)患者腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，并且隨著血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和(或)血管緊張素受體阻滯劑(ARB)在各種腎病患者中的廣泛應(yīng)用及深入研究，越來(lái)越多的臨床證據(jù)表明，隨治療時(shí)間的延長(zhǎng),ALD脫逸現(xiàn)象的發(fā)生導(dǎo)致其降壓外的器官保護(hù)效應(yīng)亦逐漸消失。因此，找尋腎小管間質(zhì)纖維化可能的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施，具有十分重要的衛(wèi)生、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

ALD是調(diào)節(jié)人體水鹽代謝的重要激素，除腎上腺皮質(zhì)外，肺動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肝臟、腎臟及腦組織中均發(fā)現(xiàn)ALD合成酶，其可催化合成單乙酰基ALD，并通過(guò)旁分泌或自分泌的方式在局部發(fā)揮作用。過(guò)去一直認(rèn)為，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素-ALD系統(tǒng)中造成腎損傷的主要物質(zhì)。近年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展性腎臟疾病中，ALD亦是重要的獨(dú)立的致病因子，其可通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)和直接作用促進(jìn)腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展，具有完全不依賴(lài)AngⅡ的獨(dú)立的致器官纖維化作用，是有絲分裂和膠原合成的強(qiáng)烈刺激劑[3]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床資料均表明，腎臟疾病的進(jìn)展與ALD有密切關(guān)系。各種腎衰竭動(dòng)物模型及臨床慢性腎衰竭患者均存在高ALD血癥，在大鼠腎衰竭模型中，ALD水平與高血壓、蛋白尿和組織損傷的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[9]。Walker等[10]亦報(bào)道了糖尿病腎病患者血漿ALD水平與腎損傷程度明顯相關(guān)。隨著ACEI及ARB在腎病患者中的廣泛應(yīng)用及深入研究，越來(lái)越多的臨床證據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，ALD脫逸現(xiàn)象的發(fā)生導(dǎo)致其降壓外的器官保護(hù)效應(yīng)亦逐漸消失。而該效應(yīng)在加用ALD受體拮抗劑后又再次出現(xiàn)[11]。以上均提示ALD在殘余腎的進(jìn)一步損傷中起著重要的作用。ALD引起腎損傷的機(jī)制涉及多個(gè)方面。在大鼠抗thy1.1系膜增生性腎小球腎炎模型、單側(cè)腎切除致高血壓的大鼠模型、殘余腎衰竭模型、慢性環(huán)胞霉素A腎毒性、糖尿病腎病的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ALD能增加前炎性因子的表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、刺激腎間質(zhì)COLⅠ合成和纖維連接蛋白分泌，而ALD受體拮抗劑，則可減低上述炎性因子及TGF-β1的表達(dá)，延緩腎間質(zhì)纖維化的形成，但具體機(jī)制尚不明確。與以往的報(bào)道相一致，本試驗(yàn)結(jié)果提示ALD可明顯上調(diào)HK-2細(xì)胞COLⅠ、Ⅲ mRNA和蛋白的表達(dá)，證實(shí)ALD可直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞COLⅠ、Ⅲ的合成與分泌，同時(shí)鹽皮質(zhì)激素受體(MR)拮抗劑EPL可拮抗上述效應(yīng)。

本研究證實(shí)，ALD可激活HK-2細(xì)胞Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路。Nagatoya等[12]用Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)的特異性抑制劑Y-27632干預(yù)小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎間質(zhì)纖維化模型，發(fā)現(xiàn)其早期炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，小管間質(zhì)纖維化也明顯減輕，提示Rho激酶可能通過(guò)介導(dǎo)早期炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)分泌參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。Sun等[13]報(bào)道，Rho激酶通過(guò)TGF-β1依賴(lài)旁路參與ALD誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)損傷。但迄今為止，Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與ALD誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞膠原的合成國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究證實(shí)，ALD可激活HK-2細(xì)胞Rho激酶的活化，同時(shí)Rho激酶抑制劑可抑制ALD誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞COLⅠ、Ⅲ的分泌。

綜上所述，本試驗(yàn)證實(shí)ALD可激活HK-2細(xì)胞Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路，并通過(guò)Rho激酶誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞COLⅠ、Ⅲ的分泌，從而加速腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

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Study on expressions of collagen Ⅰ and Ⅱ in aldosterone-induced human kidney tubular epithelial cells*

HuangHaiyang1，WeiJiali2△

(1.CentralLaboratory；2.DepartmentofNephrology,HainanProvincialGeneralHospital,Haikou,Hainan570100,China)

ObjectiveTo investigate the role of Rho kinase on collagen(COL)Ⅰ and Ⅲ expression of human renal tubular epithelial cells.MethodsHuman kidney tubular epithelial (HK-2) cells were cultured in the RPMI-1640 culture solution containing 15% fetal bovine serum.After 30 min pretreatment by the ALD receptor antagonist eplerenone(10 μmol/L) and Rho kinase inhibitor Y27632(1 μmol/L),100 nmol/L ALD acted the HK-2 cells for 24 h.The expressions of collagenⅠ and Ⅲ mRNA in each group were detected by real time PCR and the expression levels of COL Ⅰ,Ⅲ and Rho kinase protein were detected by ELISA.ResultsALD could up-regulate the expressions of COLⅠ,Ⅲ mRNA in HK-2 cells,and increased the levels of Rho kinase,COLⅠ and Ⅲ protein,while the Rho kinase inhibitor Y27632 and ALD receptor inhibitor eplerenone could antagonize these effects.ConclusionALD could activate Rho kinase signal transduction pathway in HK-2 cells and accelerate the progression of tubular interstitial fibrosis via Rho kinase induced expression of COL Ⅰ and Ⅲ.

aldosterone；collagen-Ⅰ;collagen-Ⅲ；Rho kinase；human proximal tubular epithelial cells；tubular interstitial fibrosis

海南省社會(huì)發(fā)展科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2012SF04、2013SF04和2015SF43)。作者簡(jiǎn)介：黃海燕(1980-)，主管技師，本科，主要從事細(xì)胞遺傳學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:wjl525@163.com。

R692

A

1671-8348(2016)21-2900-03

2016-01-24

2016-04-11)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.006