向　玲，張雨婷，梁　平，韋　紅，彭玲瓏，李祿生

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)外科/國(guó)家重點(diǎn)臨床?？疲貞c 400014)

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不同程度彌漫性軸索損傷動(dòng)物模型建立研究*

向玲，張雨婷，梁平，韋紅，彭玲瓏，李祿生△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)外科/國(guó)家重點(diǎn)臨床?？疲貞c 400014)

目的自制一種彌漫性軸索損傷(DAI)裝置，建立不同程度的DAI動(dòng)物模型。方法選取成年雄性清潔級(jí)SD大鼠70只，分為正常對(duì)照組(10只)與致傷組(60只)，進(jìn)一步將致傷組分為A、B、C 3組，各20只。運(yùn)用自制的實(shí)驗(yàn)裝置致傷，使大鼠的頭顱同時(shí)產(chǎn)生瞬間超大角加速度和線加速度，在恒定氣壓下通過(guò)不同的旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)次數(shù)，造成輕型(A組)、中型(B組)、重型(C組)3種不同程度的大鼠DAI損傷模型，進(jìn)行行為及病理效應(yīng)評(píng)價(jià)。結(jié)果隨著損傷程度的加重，損傷急性期致傷組大鼠的神經(jīng)生理反射恢復(fù)的時(shí)間間隔與蘇醒時(shí)間均增加(P<0.05)，致傷7 d后致傷組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)；致傷后14 d內(nèi)A、B、C 3組大鼠死亡率分別為5.0%、25.0%、50.0%。隨著損傷程度的加重，DAI病理特征改變更為明顯。結(jié)論該裝置能有效建立不同損傷程度的DAI動(dòng)物模型。

彌漫性軸索損傷；實(shí)驗(yàn)裝置；動(dòng)物模型；大鼠

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)是一種常見(jiàn)的顱腦損傷，其病情重、治療難、預(yù)后差、病死率高[1-5]。目前，DAI的致傷機(jī)制尚不完全明確，模型的研究仍是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外致力探討的課題。因此，筆者參照Gennarelli等[6]和馮氏[7]致傷裝置，模擬DAI發(fā)生機(jī)制，自制了一種簡(jiǎn)便、可靠、穩(wěn)定的損傷裝置，使大鼠的頭顱能同時(shí)產(chǎn)生瞬間超大角加速度和線加速度，并建立不同損傷程度的大鼠DAI模型，為深入研究DAI提供有用工具。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取成年雄性清潔級(jí)SD大鼠70只，體質(zhì)量300～400 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(10只)和致傷組(60只)，致傷組按隨機(jī)數(shù)字表法再分為A、B、C 3組，各20只。

1.2DAI致傷裝置的研制

1.2.1原理及實(shí)驗(yàn)裝置該裝置為一個(gè)高氣流率驅(qū)動(dòng)的氣動(dòng)轉(zhuǎn)換裝置，通過(guò)電動(dòng)充氣泵充氣使動(dòng)力氣缸氣壓達(dá)到預(yù)先設(shè)定的預(yù)壓氣壓(0.8 kpa)，啟動(dòng)氣動(dòng)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)推動(dòng)齒輪滑塊瞬間向右做線加速度運(yùn)動(dòng)，在滑塊的帶動(dòng)作用下，通過(guò)齒輪齒條的嚙合作用，齒輪同時(shí)發(fā)生圍繞其中心的旋轉(zhuǎn)和沿導(dǎo)軌的直線運(yùn)動(dòng)，同時(shí)產(chǎn)生瞬間超大線加速度和角加速度復(fù)合運(yùn)動(dòng)。頭顱旋轉(zhuǎn)裝置完成90°順時(shí)針旋轉(zhuǎn)后，借助于彈簧壓縮緩沖裝置而停止，再次啟動(dòng)氣動(dòng)轉(zhuǎn)換裝置觸發(fā)按鈕，使齒輪滑塊反向加速運(yùn)動(dòng)，帶動(dòng)頭顱旋轉(zhuǎn)裝置90°逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，即完成一次90°旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)。連續(xù)觸發(fā)氣動(dòng)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，可實(shí)現(xiàn)多次往返旋轉(zhuǎn)加速運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1。

1.2.2操作方法操作時(shí)，大鼠用4%水合氯醛腹腔麻醉后(0.3 mL/100 g)，將其頭部?jī)蓚?cè)顳骨及頭頂部墊以棉花，旋轉(zhuǎn)左、右、上的螺絲棒將頭顱固定于中心位，大鼠連接器處于水平位。啟動(dòng)電動(dòng)充氣泵，充氣至0.8 kpa后，多次觸發(fā)氣動(dòng)轉(zhuǎn)換裝置，可使大鼠頭顱行多次90°旋轉(zhuǎn)往返運(yùn)動(dòng)。整個(gè)過(guò)程保證氣壓恒定。

1.3方法

1.3.1不同程度DAI模型的建立致傷組大鼠經(jīng)4%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉后，固定于實(shí)驗(yàn)裝置上。A、B、C 3組分別行1、2、3次往返加速運(yùn)動(dòng)，致傷大鼠頭顱(分別為輕度、中度、重度致傷)；正常對(duì)照組大鼠麻醉后固定在致傷裝置上，不致傷，1 min后將大鼠卸下。

1.3.2觀察大鼠神經(jīng)生理反射觀察損傷急性期(24 h內(nèi)，每分鐘測(cè)定1次直至恢復(fù)正常)致傷組大鼠的神經(jīng)生理反射(角膜反射、后肢爪反射、翻正反射)恢復(fù)的時(shí)間間隔及大鼠生命體征變化。

1.3.3大鼠腦組織大體形態(tài)和病理學(xué)形態(tài)觀察于損傷后24 h分別在正常對(duì)照組及A、B、C組中各抽取3只大鼠，用4%水合氯醛腹腔麻醉后，快速開(kāi)胸，左心室插管至主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，灌注0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，至流出液清亮后停止灌注，換用4%多聚甲醛溶液灌注，至大鼠四肢及尾巴抽搐、雙肺及肝臟顏色變白為止。灌注完成后迅速取腦，完整剝離全腦包括大腦、小腦、腦干，同時(shí)肉眼觀察大體標(biāo)本的病理變化后，遂將標(biāo)本組織投入4%多聚甲醛溶液于4 ℃固定48 h；腦干和大腦冠狀位切開(kāi)，大腦沿腦中線矢狀位切開(kāi),分別進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，腦干和大腦分別冠狀位切片5 μm厚，行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.3.4大鼠神經(jīng)功能評(píng)分于損傷后7 d參照文獻(xiàn)[8]的Carcia JH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)，分別對(duì)A、B、C 3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，并統(tǒng)計(jì)14 d內(nèi)A、B、C 3組的死亡率。

2　結(jié)　　果

2.1損傷急性期大鼠生命體征及神經(jīng)生理反射恢復(fù)時(shí)間與蘇醒時(shí)間比較大鼠致傷后出現(xiàn)不同程度的肢體抽搐、大小便失禁和呼吸暫停，呼吸節(jié)律不齊，由淺快到深慢再到淺快，后慢慢趨于平穩(wěn)。3組大鼠損傷后均出現(xiàn)角膜反射、后肢爪反射及翻正反射消失。角膜反射、后肢爪反射、翻正反射的平均恢復(fù)時(shí)間在A組與B組、B組與C組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與B組、B組與C組蘇醒時(shí)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。蘇醒后大鼠出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減少、反應(yīng)減慢、行走不穩(wěn)。

①：底座(長(zhǎng)36 cm、寬25 cm)；②：動(dòng)力氣缸；③：大鼠連接器，包括大鼠放置臺(tái)(長(zhǎng)14 cm、寬13 cm)，左右上3根旋轉(zhuǎn)螺絲棒(分別長(zhǎng)6、6、4 cm)；④：旋轉(zhuǎn)部分(擺動(dòng)金屬桿、滑塊、齒輪、齒條)；⑤：電池閥；⑥：通氣管(2條)；⑦：擺動(dòng)桿。

圖1　　DAI致傷裝置

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

2.2神經(jīng)功能評(píng)分與死亡率致傷后7 d對(duì)3組大鼠行神經(jīng)功能評(píng)分，隨往返加速運(yùn)動(dòng)次數(shù)增加，3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。致傷后14 d內(nèi)A、B、C 3組大鼠死亡率分別為5.0%、25.0%、50.0%，其中C組與A組及B組死亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3病理學(xué)改變?nèi)庋巯?，正常?duì)照組和A、B、C 3組大鼠大腦表面、蛛網(wǎng)膜下腔、腦室等區(qū)域均未見(jiàn)明顯出血病灶，見(jiàn)圖2。光鏡下正常對(duì)照組可見(jiàn)神經(jīng)束排列整齊且無(wú)空泡形成；A組可見(jiàn)大腦胼胝體區(qū)、灰白質(zhì)交界區(qū)、腦干等部位神經(jīng)束疏松、紊亂，血管淤滯，空泡形成，神經(jīng)元腫脹變性，細(xì)胞核顯示不清，突觸結(jié)構(gòu)模糊的典型DAI病理特征。B組與A組比較，C組與B組比較，其神經(jīng)束排列更疏松、紊亂，空泡形成及神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性更明顯，見(jiàn)圖3。

表3　　3組不同程度致傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及死亡率比較

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

A：正常對(duì)照組；B：輕度致傷；C：中度致傷；D：重度致傷。

圖2致傷24 h大鼠腦大體標(biāo)本情況

A：正常對(duì)照組；B：輕度損傷；C：中度損傷；D：重度損傷；E：正常對(duì)照組；F：輕度損傷；G：中度損傷；H：重度損傷。

圖3胼胝體神經(jīng)纖維束及灰白質(zhì)交界區(qū)、腦干等部位神經(jīng)元損傷情況(HE染色，×400)

3　討　　論

DAI是導(dǎo)致顱腦外傷患者重度傷殘、植物狀態(tài)及死亡的常見(jiàn)原因[1-5，9]。各種暴力作用于頭部產(chǎn)生線或角加速度，在腦組織內(nèi)產(chǎn)生剪切力，導(dǎo)致神經(jīng)軸索損傷甚至斷裂、毛細(xì)血管撕裂，使腦深部白質(zhì)發(fā)生廣泛彌漫損傷即DAI[10]。其發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，是神經(jīng)外科研究的重要內(nèi)容，有研究證明頭部直線和旋轉(zhuǎn)加速運(yùn)動(dòng)是導(dǎo)致DAI最重要的機(jī)制之一[11]。為模擬該損傷機(jī)制，筆者參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)致傷裝置，自制了一種可以使大鼠的頭顱同時(shí)產(chǎn)生瞬間超大角加速度和線加速度的致傷裝置。

DAI動(dòng)物模型的建立在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有較多研究，如瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型[6，12]、液壓沖擊損傷模型[13]、打擊負(fù)荷損傷模型[14]、加速或減速損傷模型[15]、牽拉損傷模型[16]等。目前，眾多學(xué)者對(duì)DAI損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)趨于一致，即外力使頭部產(chǎn)生線或角加速度，由于腦各組織的物理質(zhì)量不同，其運(yùn)動(dòng)速度不均，易受剪切力作用，導(dǎo)致神經(jīng)軸索損傷甚至斷裂。因此，筆者在參照Gennarelli等[6]和馮氏[7]的致傷裝置基礎(chǔ)上，加以改進(jìn)，模擬直線加速和角加速的發(fā)生機(jī)制，制作了一種由恒定氣壓推動(dòng)可同時(shí)產(chǎn)生恒定線加速度和角加速度的實(shí)驗(yàn)裝置。借助氣動(dòng)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)90°順時(shí)針、逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)，并保持恒定的線加速度及角加速度。該裝置結(jié)合了直線加速及旋轉(zhuǎn)加速損傷機(jī)制，更符合臨床實(shí)際中DAI的發(fā)生機(jī)制。

臨床上DAI患者的預(yù)后差別很大，主要由損傷當(dāng)時(shí)的嚴(yán)重程度決定。因此，建立一個(gè)穩(wěn)定的可以反映不同損傷程度的動(dòng)物模型，用于DAI的治療及預(yù)后研究具有重大意義。既往報(bào)道中尚缺乏對(duì)DAI損傷程度進(jìn)行分級(jí)的研究，因此筆者擬通過(guò)調(diào)控旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)次數(shù)，來(lái)實(shí)現(xiàn)不同程度致傷。

本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，僅對(duì)大鼠做1次順時(shí)針90°旋轉(zhuǎn)加速運(yùn)動(dòng)后，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)未見(jiàn)明顯彌漫性軸索損傷病理學(xué)改變；做1次90°順時(shí)針、逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)后，病理組織學(xué)可見(jiàn)輕度彌漫性軸索損傷病理改變；行4次往返運(yùn)動(dòng)致傷后大鼠的死亡率極高，無(wú)法完成實(shí)驗(yàn)。因此，筆者分別給予A、B、C 3組1、2、3次旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)，制造不同程度DAI模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組大鼠致傷后在神經(jīng)生理反射、神經(jīng)功能評(píng)分及病理組織學(xué)改變上均符合DAI表現(xiàn)，且組間有明顯差異。既往很多實(shí)驗(yàn)裝置建模后，大體標(biāo)本可見(jiàn)明顯出血灶[17-18]，實(shí)際上是一種復(fù)合型損傷，并非單純的DAI，本實(shí)驗(yàn)在致傷后24 h，A、B、C 3組大鼠肉眼下大腦表面、蛛網(wǎng)膜下腔、腦室等區(qū)域均未見(jiàn)明顯出血病灶，而病理組織學(xué)改變上符合DAI的表現(xiàn)，因此本裝置所建立的DAI模型屬于單純型DAI，將更有利于相關(guān)研究。

綜上所述，本裝置原理與臨床DAI發(fā)生機(jī)制相似，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單合理，易于操作，可重復(fù)性強(qiáng)，能成功構(gòu)建具有典型DAI病理學(xué)及神經(jīng)功能改變的動(dòng)物模型，且可通過(guò)調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)往返加速運(yùn)動(dòng)次數(shù)構(gòu)建不同的損傷程度，是一種較為理想的DAI損傷裝置。

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Study on the establishment of rat model of different degree of diffuse axonal injury*

XiangLing，ZhangYuting，LiangPing，WeiHong，PengLinglong，LiLusheng△

(DepartmentofNeurosurgery/NationalKeyClinicalSpecialist,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo establish the different degrees of rat diffuse axonal injury (DAI) model by using a self-made DAI device.MethodsA total of 70 healthy adult clean SD rats were selected and randomly divided into the normal control group (n=10) and DAI group (n=60),then the DAI group was randomly subdivided into the group A,B,and C,20 cases in each group.The rat head injury model was prepared by using the self-made experimental device,which made the rat head to simultaneously produce instant oversized linear and angular accelerations,different degrees of rat DAI model,including mild DAI(group A),moderate DAI (group B) and severe DAI(group C),were induced by different rotation back and forth,accelerated movement times under the constant air pressure.The pathological and behavior effect evaluation was performed.ResultsWith the injury degree aggravating,the time interval of nerve physiological reflex recovery and awakening time in the acute DAI groups were increased (P<0.05).The nerve function score after 7 d in the DAI groups was decreased (P<0.05); the death rates within 14 d after injury in the group A,B and C were 5.0%,25.0% and 50.0% respectively.With the injury degree aggravating,the DAI pathological characteristics were more significant.ConclusionThis device could effectively establish different injury degrees of DAI animal model.

diffuse axonal injury；experimental facility；animal model；rat

國(guó)家臨床重點(diǎn)專科資助項(xiàng)目(X3257)；重慶市科委科技攻關(guān)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)類項(xiàng)目(cstc2012gg-yyjs10013)。作者簡(jiǎn)介：向玲(1988-)，在讀碩士，主要從事小兒腦損傷研究?！?/p>

，E-mail:404616073@qq.com。

R651.15

A

1671-8348(2016)21-2881-04

2016-01-08

2016-03-26)

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.001