楊嘉永　劉碧麗

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【實驗研究】

茅蒼術(shù)對H9c2心肌細胞氧化損傷的保護作用

楊嘉永劉碧麗

廈門大學附屬第一醫(yī)院藥學部(廈門 361003)

摘要：目的茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對H9c2該細胞的保護效果的研究。方法采用雙氧水制造 H9c2 大鼠心肌細胞的氧化損傷模型，以Vc為陽性對照，通過對受損心肌細胞形態(tài)學觀測、SOD活力檢測及細胞相對凋亡情況的檢測，測定茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對H9c2細胞的保護效果。結(jié)果不同濃度的茅蒼術(shù)水煎液均使細胞生長狀態(tài)得以改善，外部形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。高劑量組細胞生長較好，中劑量組次之，低劑量組較差；茅蒼術(shù)水煎液組 LDH 釋放量和MDA 含量明顯低于 Vc 對照組，SOD 活力明顯高于損傷組；細胞的相對存活率隨著茅蒼術(shù)水提液的濃度升高而明顯增大，分別為72.37%、66.19%、55.44%，低劑量組的茅蒼術(shù)水提液對 H2O2 損傷的 H9c2 心肌細胞的保護作用不明顯。結(jié)論茅蒼術(shù)水提液的保護作用機制與增強細胞抗氧化能力、減少自由基和脂質(zhì)過氧化物導致的細胞膜損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞：茅蒼術(shù)；H9c2心肌細胞；保護作用

茅蒼術(shù)Atractylodeslancea為常用中藥，在我國有悠久的臨床應用歷史，因其主要成分揮發(fā)油過量對人體有明顯的不良作用，因此研究其水溶性成分是當務之急。本研究采用雙氧水制造H9c2大鼠心肌細胞的氧化損傷模型，以Vc為陽性對照，測定茅蒼術(shù)水煎液和它的含藥血清對H9c2細胞的保護效果，以期達到評價其抗氧化作用的效果，找出發(fā)揮抗氧化的藥效物質(zhì)，為茅蒼術(shù)進一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供理論依據(jù)。

1　材料與設(shè)備

1.1實驗儀器CO2細胞培養(yǎng)箱：MCO-20AIC型，日本三洋SANYO；倒置顯微鏡：CKX31型，日本奧林巴斯OLYMPUS；全自動滅菌鍋：ES315型，日本TOMY；高速冷凍離心機：5811U型，德國Eppenodorf公司；超純水制備系統(tǒng)：Synergy型，美國密理博Millipore；水浴鍋：HR-06型，Guohua公司； 10,100,1000 μL微量加樣器：Eppendorf，Germany；酶標儀：ELX800，BioTek，USA；H9c2大鼠心肌細胞株，購自中科院上海細胞庫。

1.2實驗試劑澳洲胎牛血清：批號1431602，Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)液：批號NYH0948，Gibco；青鏈霉素混合液(100X)：批號20140417，Solarbio；0.25%胰蛋白酶：(1：250，25 g)，批號20140216，Gibco；PBS磷酸鹽緩沖液：0.01 mol·L-1，PH 7.2～7.4，批號509E024，Solarbio；MTT：批號1028D005，Solarbio；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒：批 號分 別為20140416、20140332、20140423，上?；鈱崢I(yè)有限公司。

2　實驗方法與結(jié)果

2.1茅蒼術(shù)提取物的制備茅蒼術(shù)藥材采自江蘇茅山，陰干備用。準確稱取粉碎過篩的茅蒼術(shù)，以重蒸水提前浸泡1 h，加水回流提取1 h，紗布過濾，藥渣繼續(xù)提取1 h，合并兩次的濾液并濃縮成浸膏狀，于65℃烘干，得茅蒼術(shù)提取物(每克相當于生藥約3.5 g)。稱取以上項已制備好的茅蒼術(shù)提取物約0.2 g，精密稱定，置于小燒杯中，緩慢加入95%乙醇，慢加快攪，至不再有絮狀物析出為止。

2.2分析方法

2.2.1溶液配制PBS緩沖液(PH=7.2)的配制：將一包PBS粉 末溶 于2 L的三 蒸 水里，溶 解，121℃滅30 min，備用。DMEM雙抗培養(yǎng)液：DMEM 500 mL +雙 抗5.5 mL，4℃存放。10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液：胎牛血清10 mL+ DMEM 90 mL，混勻，4℃存放。

2.2.2實驗分組將96孔板中已經(jīng)培育24 h的H9c2細胞更換新的培養(yǎng)液，根據(jù)預實驗的情況，分組處理：①正常對照組：用培養(yǎng)液正常培養(yǎng)；②H2O2損傷組：加入H2O2使其終濃度為100 μmol·L-1，作用細胞2 h；③陽性Vc組：注入Vc液使其最后濃度是500 μg·mL-1；④空白。血清組：培養(yǎng)液中加入空白血清；⑤含藥血清組：培養(yǎng)液中加入含藥血清；⑥高劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入2.1項下茅蒼術(shù)水煎液使其最后濃度為 500μg·mL-1；⑦中劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入茅蒼術(shù)水提液使其終濃度為250 μg·mL-1；⑧低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組：加入茅蒼術(shù)水提液使其終濃度為100 μg·mL-1。各處理組均為先加入 H2O2損傷2 h，再加入藥物作用24 h。觀察細胞的形態(tài)，并收集各組培養(yǎng)液，檢測LDH釋放量，SOD活力，MDA含量及細胞活力。

2.2.3觀測指標

2.2.3.1細胞形態(tài)學觀測

2.2.3.2乳酸脫氫酶(LDH)活力測定分別收集每個實驗組的上層培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測 定，血 清中LDH的活性以U·L-1表示。

乳酸脫氫酶(LDH)丙酮酸

(公式1)

將測得的值帶入以下公式，求出LDH的活性值。

LDH 的活性(U·L-1)=(A測定值-A對照值)/(A標準值-A空白值)×標準品濃度(2 mmol·L-1)× 測試前樣本稀釋倍數(shù)× 1000

(公式2)

2.2.3.3MDA含量檢測分別收集各實驗組的細胞培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測定。

MDA含量(nmol·mL-1)=(A測定值-A對照值)/(A標準值-A空白值)× 標準品濃度(10 nmol·mL-1) × 樣本稀釋倍數(shù)

(公式3)

2.2.3.4SOD 活力檢測分別收集各實驗組的細胞培養(yǎng)液，采用試劑盒說明書的方法測定。

SOD活力(U·mL-1)=(A對照值-A測定值)/A對照值÷50%×反應體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)

(公式4)

2.2.3.5細胞相對凋亡情況的檢測采用MTT比色法，用PBS配制MTT，濃度為5 mg·mL-1，在對細胞完成各種干預實驗后，每孔加入MTT 20 μL，連續(xù)培育4 h，最后停止；輕輕的吸走孔里的上清，分別加DMSO液150 μL，振搖10 min，徹底溶解甲瓚；在酶標儀的490 nm波長下，檢測每孔的A值，將各組所測得的吸光度值帶入細胞活力計算公式，求出各實驗組的細胞活力[149]。

細胞活力(%)=A實驗/A參照×100%

(公式5)

2.3實驗結(jié)果

2.3.1對細胞形態(tài)的影響用不同的藥物處理完細胞之后，將其放在倒置顯微鏡下觀測：未處理組的細胞繼續(xù)生長，成梭形或者無規(guī)則形狀，核是扁圓形或者緊貼細胞壁；H2O2損傷組和空白血清組細胞均體積變小，為圓形或者橢圓，細胞核濃縮，細胞邊緣模糊，部分發(fā)生溶解；陽性Vc作用組細胞與H2O2損傷組的相比，貼壁細胞數(shù)量較多，生長狀態(tài)較好；相對于損傷組而言，不同濃度的茅蒼術(shù)水煎液作用組貼壁細胞數(shù)量較多，且外部形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，說明其生長狀態(tài)得到了改善；不同劑量茅蒼術(shù)水提液作用組細胞的生長狀態(tài)不同，高劑量組細胞的生長較好，中劑量組的次之，低劑量組的較差。

2.3.2茅蒼術(shù)及其含藥血清對心肌細胞MDA含量、SOD活力及LDH釋放量的影響LDH釋放量、SOD的活力測定結(jié)果及MDA含量的變化情況見表1，H2O2損傷組細胞的LDH釋放量和MDA含量明顯增高，分別是正常對照組的1.38倍、4.31倍，SOD活性顯明下降，為未處理組的34%；而高、中、低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組的LDH釋放量和MDA含量都有所降低，LDH釋放量與H2O2損傷組相比分別降低了16.01%、14.80%、8.14%，MDA與H2O2損傷組相比分別降低了28.52%、60.70%、56.36%；高、中、低劑量茅蒼術(shù)水提液作用組的SOD活力都有所升高，SOD與H2O2損傷組相比分別升高了60.27%、48.55%、6.96%；而陽性Vc對照組LDH釋放量和MDA含量明顯低于損傷組，高于茅蒼術(shù)水提液作用組，SOD活力也是明顯比損傷組高。

2.3.3細胞相對凋亡情況每個處理組細胞的相對凋亡率如圖1，以未處理組的相對存活率為標準，H2O2模型組的損傷率很明顯的升高，為44.34%；茅蒼術(shù)水提液保護組細胞的存活率與茅蒼術(shù)水提液成濃度劑量關(guān)系，即細胞的相對存活率隨著茅蒼術(shù)水提液的濃度升高而明顯增大，分別為72.37%、66.19%、55.44%，低劑量組的茅蒼術(shù)水提液對H2O2損傷的H9c2心肌細胞的保護作用不明顯；跟空白參照組比對，含藥血清組細胞的生活率也較高，為67.08%；與H2O2模型組比較，正常對照組、陽性Vc組和茅蒼術(shù)水提液高濃度組成極顯著性差異，含藥血清組和茅蒼術(shù)水提液中劑量組成顯著性差異，其余組差異性不明顯。

組別LDH/U·L-1MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1正常對照組280.63±9.069.14±0.1046.54±0.18H2O2模型組388.09±8.111)3)39.44±0.082)4)15.64±0.182)4)陽性Vc對照組307.29±5.856)13.73±0.116)41.45±0.196)空白血清組350.37±5.931)36.54±0.151)3)29.75±0.491)3)含藥血清組327.11±4.535)23.26±0.145)36.69±0.255)水提液高劑量組325.97±8.225)28.19±0.161)3)39.36±0.136)水提液中劑量組330.65±7.305)15.50±0.151)6)30.40±0.211)3)水提液低劑量組356.51±10.471)17.21±0.161)6)16.81±0.852)4)

注：與正常對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與陽性Vc組比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與模型組比較，5)P<0.05，6)P<0.01

圖1　不同處理組細胞的存活率(與H2O2損傷組比對，*P<0.05，**P<0.01)

3　討論

本研究利用H9c2細胞株建立H2O2損傷模型，從細胞形態(tài)、乳酸脫氫酶、抗氧化以及細胞凋亡等方面探討茅蒼術(shù)水提液的保護作用，結(jié)果顯示，H2O2的損傷作用能使H9c2細胞皺縮變圓、數(shù)目減少；細胞膜的透過性變大，導致心肌酶向胞外漏出，培養(yǎng)液中LDH的量明顯變大；同時發(fā)生的脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生了大量自由基，培養(yǎng)液中SOD活力降低，MDA含量增大。本實驗以Vc作為保護心肌細胞的陽性對照藥物，旨在對比觀察不同劑量茅蒼術(shù)水提液的保護作用。這部分的研究顯示，Vc對被損壞的心肌細胞顯現(xiàn)出很好的保護效果，但本試驗中的Vc濃度尚不能完全阻斷H2O2對心肌細胞的損傷作用。而3種劑量茅蒼術(shù)水提液預處理，均能不同程度的改善細胞形態(tài)，提高細胞存活率，降低H2O2誘導的LDH的釋放量、提高SOD活力、減少MDA含量以及細胞的凋亡率；并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，低劑量茅蒼術(shù)水提液可使脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生與積累減少，中劑量茅蒼術(shù)水提液進而提高自由基清除能力，尤其對MDA的含量有明顯的降低作用，高劑量茅蒼術(shù)水提液同時具有增強抗氧化酶活性的作用。提示茅蒼術(shù)水提液的保護作用機制與增強細胞抗氧化能力、減少自由基和脂質(zhì)過氧化物導致的細胞膜損傷有關(guān)。

本研究建立的細胞模型比較可靠、簡單，可用于心肌細胞的損傷機制和抗氧化的藥效機理方面的研究；同時也初步證實了茅蒼術(shù)水提液及其含藥血清對H2O2所致心肌細胞的損傷具有保護作用，推測茅蒼術(shù)含藥血清中的入血成分可能是其發(fā)揮抗氧化作用的重要物質(zhì)之一，提示茅蒼術(shù)含藥血清中的入血成分可能是其藥效物質(zhì)。

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doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.09.021

文章編號：1003-8914(2016)-09-1248-03

收稿日期：(本文校對：劉言言2015-09-17)

Protective Effect of Atractylodes lancea on Oxidative Injury of H9c2 Myocardial Cells

YANG JiayongLIU Bili

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Fujian, Xiamen 361003, China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective activity of Atractylodes lancea decoction and its medicated serum on H9c2 cell. MethodsThe H2O2-based oxidative injury model was established by cultivating rat cardiomyocytes of H9c2 in vitro, and the antioxidant activity was evaluated by cell morphology, apoptosis and the effect on SOD. ResultsThe growth state of the cells could be improved by the decoction of the different concentrations of Atractylodes lancea, and the external form was significantly improved. The high dose group cells grew well, and the low dose group was poor. The release amount of LDH and MDA of Atractylodes lancea group were significantly lower than those of the Vc control group, SOD activity was significantly higher than that in the injury group, the relative survival rate of cells with the concentration of aqueous extract of Atractylodes lancea obviously increased, it was 72.37%, 66.19% and 55.44%, respectively. The protective effect of the aqueous extract of the low dose group on the H2O2 damage of H9c2 myocardial cells was not significant. ConclusionThe mechanism of protective effect of water extract of Atractylodes lancea liquid is related to enhancing cellular antioxidant capacity and cell membrane damage caused by reducing free radicals and lipid peroxide.

Key words：Atractylodes lancea; H9c2 myocardial cells; Protective effect