程雅韻，王 新，鄭 琳，李官浩，崔虎山，金 清，*（.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 3300；.延邊大學附屬醫(yī)院西區(qū)，吉林 延吉 33000）

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假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶基因的克隆及表達

程雅韻1，王 新1，鄭 琳1，李官浩1，崔虎山2，金 清1，*
（1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學附屬醫(yī)院西區(qū)，吉林 延吉 133000）

摘 要：利用聚合酶鏈式反應(yīng)從假腸膜明串珠菌中擴增出甘露醇脫氫酶（mannitol dehydrogenase，MDA）基因的結(jié)構(gòu)基因，克隆入表達載體pETDuet-1，構(gòu)建了甘露醇脫氫酶表達質(zhì)粒pETDuet-1-mdh，將其轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達。假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶結(jié)構(gòu)基因長度為1 017 bp，重組甘露醇脫氫酶基因在大腸桿菌內(nèi)成功表達，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.0 kD；重組甘露醇脫氫酶活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中甘露醇脫氫酶活力0.03 U/mg pro。

關(guān)鍵詞：甘露醇；甘露醇脫氫酶；假腸膜明串珠菌；基因克??；表達

引文格式：

程雅韻， 王新， 鄭琳， 等.假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶基因的克隆及表達［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 153-156.

CHENG Yayun， WANG Xin， ZHENG Lin， et al.Cloning and expression of mannitol dehydrogenase gene from Leuconostoc pseudomesenteroides［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 153-156.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613027. http://www.spkx.net.cn

甘露醇（mannitol），學名己六醇，是六元糖醇的一種，別名D-甘露糖醇、木蜜醇，為山梨醇的同分異構(gòu)體［1］。甘露醇具有清涼的甜味，甜度為蔗糖的60%，不易吸潮，還具有熱量低、無毒、無副作用等特點。甘露醇被人體吸收后的代謝不依靠胰島素，故不提高血糖值。甘露醇不會作為口腔微生物的營養(yǎng)源，可抑制突變鏈球菌的生長繁殖。甘露醇沒有還原基，不參與美拉德反應(yīng)，不容易焦化。由于甘露醇具有特殊的物理和化學性質(zhì)，甘露醇可作麥芽糖、口香糖、糕點等食品的防黏劑，也可作糖尿病、肥胖病人的低熱值食品和低糖食品的甜味劑和功能性食品添加劑等，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［2］。

生產(chǎn)甘露醇的方法主要有提取法、化學合成法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法等［3-6］。其中微生物發(fā)酵法可以提高甘露醇的產(chǎn)率并且能避免山梨醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，成為甘露醇生產(chǎn)的主要發(fā)展趨勢［7］。目前已經(jīng)報道了多種微生物具有生產(chǎn)甘露醇的能力，包括霉菌、酵母菌和細菌，其中乳酸菌代謝途徑中的甘露醇脫氫酶（mannitol dehydrogenase，MDH）可有效轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇［8-12］。目前，已經(jīng)對短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等乳酸菌所產(chǎn)的甘露醇脫氫酶進行了純化和特性分析，并探討了這些乳酸菌作為甘露醇生產(chǎn)菌株的可行性［11-13］，結(jié)果表明這些菌株因甘露醇轉(zhuǎn)化率低或生長速率緩慢而不適于作生產(chǎn)用菌株。

假腸膜明串珠菌作為異型發(fā)酵乳酸菌的一種，其所產(chǎn)的甘露醇脫氫酶是甘露醇生成過程中的關(guān)鍵酶，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）或煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（dihydronicotinamide adenine dinuclectide phosphate，NADPH）為輔酶催化果糖生成甘露醇［14］。近年來，假腸膜明串珠菌作為甘露醇生產(chǎn)優(yōu)良菌株受到廣泛關(guān)注［15］。為將假腸膜明串珠菌及其所產(chǎn)MDH有效應(yīng)用于甘露醇生產(chǎn)，必須對其酶學特性進行分析，并提高酶的表達量。

因此，本課題組以遺傳及生理機能都被熟知的大腸桿菌作為宿主細胞，利用基因工程技術(shù)，將假腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)入其中，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)使其異源表達，提高MDH的表達量和酶活性，為進一步研究MDH酶學特性并將假腸膜明串珠菌MDH應(yīng)用于甘露醇的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

假腸膜明串珠菌KCTC3652（Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652） 韓國生物資源中心（Korean Collection for Type Cultures，KCTC）；表達質(zhì)粒pETDuet-1 質(zhì)粒、大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株和表達菌株E.coli BL21（DE3）為延邊大學食品科學系食品科學實驗室保存。

核糖核酸酶（RNaseA）、溶菌酶（lysozyme）、IPTG、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、瓊脂糖、過硫酸銨、丙烯酰胺、甘氨酸、2-巰基乙醇、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷、硼酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）metyl aminomethane，Tris）、考馬斯亮藍、乙二胺四乙酸二鈉、甘油、溴酚藍阿拉丁、核酸染料 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；磷酸二氫鉀 沈陽市華東試劑廠；D-果糖、磷酸氫二鉀、冰乙酸、甲醇、無水乙醇、鹽酸 天津科密歐化學試劑有限公司；DL15 000 DNA Marker、T4 DNA連接酶、堿性磷酸酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ和EcoRⅠ、HSTMMix、蛋白質(zhì)標準Marker 日本TaKaRa公司；NADH 美國Sigma公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、膠提取試劑盒、DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 美國Omega公司。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；U3900紫外-可見光分光光度計 日本日立公司；Z400K高速冷凍離心機 德國Hermle公司；JYD-150智能型超聲波細胞粉碎機 上海信之儀器有限公司；TU-100恒溫金屬浴上海一恒科技有限公司；EPS-300電泳儀 上海天能科技有限公司；ZWY-100H/240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；GelDoc2000凝膠成像儀、1658001 SDS-PAGE電泳儀 美國Bio-Rad公司；PTC-225 PCR儀 美國MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

假腸膜明串珠菌KCTC3652的基因組DNA提取步驟按DNA提取試劑盒操作步驟進行，提取基因組總DNA經(jīng)驗證后置于－20 ℃條件下保存。

1.3.2 表達載體pETDuet-1-mdh的構(gòu)建

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中MDH基因序列信息（該基因序列已經(jīng)在歐洲分子生物學實驗室（The European Molecular Biology Laboratory，EMBL）核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中報道，登錄號為AJ486977）設(shè)計引物Lpmdh-FEcoRⅠ（5′-TTGAATTCAATGGAAGCACTTGTGTTAA CT-3′）和Lpmdh-R-SacⅠ（5′-TTGAGCTCTTATGCCT CTTCGCCAC-3′）后，以假腸膜明串珠菌KCTC3652基因組DNA為模板，進行MDH結(jié)構(gòu)基因的PCR擴增［16］。PCR反應(yīng)體系如下：HSTMMix 25 μL；Lpmdh-FEcoRⅠ、Lpmdh-R-SacⅠ各1 μL（終濃度1 μmol/L）；假腸膜明串珠菌KCTC3652基因組DNA提取液1 μL；加雙蒸水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)液進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對擴增片段進行膠回收提取純化后進行EcoR I和SacⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切的pETDuet-1載體連接，構(gòu)建一個新的重組質(zhì)粒pETDuet-1-mdh。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Top10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，并經(jīng)PCR擴增和酶切進行鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。將基因測序正確的重組質(zhì)粒pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)化表達宿主E.coli BL21（DE3）。

1.3.3 表達載體pETDuet-1-mdh的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒pETDuet-1-mdh 2 μL轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）進行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中（終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素），在37 ℃振蕩培養(yǎng)，直至OD600 nm值達到0.6時加入1 mmol/L 的IPTG，20 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，采集菌體懸浮液［17］。將菌體懸浮液在4 ℃、8 000×g條件下離心5 min 收集菌體，用生理鹽水清洗菌體2 次，再加入發(fā)酵液初始體積的1% pH 7.0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體，超聲波裂解菌體細胞直至菌體溶液澄清，得到菌體裂解液。將菌體裂解液在4 ℃、15 000×g離心30 min，對菌體裂解液和離心后上清液蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析［18］。

1.3.4 MDH活性測定

MDH活性測定溶液包括100 mmol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，200 mmol/L NADH和200 mmol/L D-果糖，加入上述上清液作為重組酶粗提液起始反應(yīng)。MDH的活性通過測定NADH在340 nm波長處的吸光度變化測得［19］。酶活力單位定義為1 min消耗1 mol NADH所用的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露醇脫氫酶生物學信息

根據(jù)EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫提供的生物學信息（圖1），假腸膜明串珠菌mdh基因片段大小為1 017 bp，編碼338 個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小為36.0 kD。

2.2 mdh基因的克隆和表達載體構(gòu)建

以假腸膜明串珠菌基因組DNA為模板，使用Lpmdh-F-EcoRⅠ和Lpmdh-R-SacⅠ為引物，進行mdh基因的PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，擴增產(chǎn)物在約1 000 bp處有明顯的擴增條帶，同預(yù)期目的片段（1 017 bp）大小相符（圖2）。擴增片段膠回收提取純化后經(jīng)EcoR Ⅰ和SacⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切的pETDuet-1載體連接，構(gòu)建表達載體pETDuet-1-mdh（圖3）。轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細胞篩選陽性單克隆菌，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行EcoR Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，雙酶切產(chǎn)生5 420 bp和1 000 bp兩條條帶，分別對應(yīng)線性表達載體和插入目的基因大小，且該陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證序列正確、無突變現(xiàn)象，表明mdh基因的表達載體成功構(gòu)建。將基因測序正確的重組質(zhì)粒pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coli BL21（DE3）。

2.3 表達載體pETDuet-1-mdh的誘導(dǎo)表達

分別將pETDuet-1和pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）培養(yǎng)，對兩種菌株的全菌體蛋白和菌體破碎上清液進行了SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示。泳道1和2的pETDuet-1轉(zhuǎn)化菌株全菌體蛋白和上清液蛋白在36.0 kD處無蛋白條帶，而泳道3和4的表達載體pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)化菌株在36.0 kD處有明顯的表達蛋白條帶且與預(yù)測MDH大小相當，破碎液上清液中檢測出同樣蛋白條帶，說明重組菌株表達了MDH且表達可溶。

2.4 MDH的活性分析

重組質(zhì)粒pETDuet-1-mdh轉(zhuǎn)化菌株粗酶液中MDH活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中MDH活力（0.03 U/mg pro），而pETDuet-1轉(zhuǎn)化菌株粗酶液中未測定出酶活力，說明重組菌株成功表達了MDH且活性較高。

3 結(jié) 論

大腸桿菌是應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一。假腸膜明串珠菌作為異型發(fā)酵乳酸菌的一種，產(chǎn)生MDH，在NADH或NADPH為輔酶催化果糖生成甘露醇，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的關(guān)鍵酶。本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)探索了高效表達假腸膜明串珠菌中MDH的方法，首先利用PCR從假腸膜明串珠菌中擴增出mdh的結(jié)構(gòu)基因，然后克隆入表達載體pETDuet-1，構(gòu)建了MDH表達質(zhì)粒pETDuet-1-mdh，將其轉(zhuǎn)化進入E.coli BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達。重組甘露醇脫氫酶基因在大腸桿菌內(nèi)成功表達且表達可溶，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.0 kD，活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中MDH活力0.03 U/mg pro。今后通過對轉(zhuǎn)化pETDuet-1-mdh的重組大腸桿菌菌株培養(yǎng)條件和IPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，進一步提高假腸膜明串珠菌mdh基因在大腸桿菌中的表達量，提高酶的活性，為研究其酶學特性和將假腸膜明串珠菌MDH應(yīng)用于甘露醇的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0153-04

收稿日期：2016-01-25

基金項目：國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31260362）；吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究項目（吉教科合字［2015第40號］）

作者簡介：程雅韻（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：1748731183@qq.com

*通信作者：金清（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：jinqing@ybu.edu.cn

Cloning and Expression of Mannitol Dehydrogenase Gene from Leuconostoc pseudomesenteroides

CHENG Yayun1， WANG Xin1， ZHENG Lin1， LI Guanhao1， CUI Hushan2， JIN Qing1，*
（1.Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002， China；2.West District of Affiliated Hospital of Yanbian University， Yanji 133000， China）

Abstract:The structural gene encoding mannitol dehydrogenase （MDH） from Leuconostoc pseudomesenteroides was amplified by PCR and cloned into the vector pETDuet-1.As a result， the plasmid pETDuet-1-mdh was constructed and transformed into E.coli BL21（DE3） for MDH expression induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG）.The length of the mdh structural gene was l 017 bp.The recombinant mdh gene was successfully expressed in Escherichia coli and the molecular weight of the expressed protein was 36.0 kD.The activity of recombinant mannitol dehydrogenase was 0.15 U/mg pro， which was higher than the MDH activity of Leuconostoc pseudomesenteroides （0.03 U/mg pro）.

Key words:mannitol； mannitol dehydrogenase； Leuconostoc pseudomesenteroides； gene cloning； expression