覃嶺　何峰　吳維宇　張雪蓮　趙奎

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 成都 610500)

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不同灌流吸附材料對(duì)急性百草枯中毒患者血清IL-6、IL-8及氧自由基損傷的影響*

覃嶺何峰吳維宇張雪蓮趙奎

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 成都 610500)

【摘要】目的探討不同血液灌流吸附材料對(duì)急性百草枯中毒患者血清IL-6、IL-8和氧自由基損傷的影響。方法40例急性百草枯中毒患者隨機(jī)分入A組和B組各20例。A組采用HA-230樹(shù)脂血液灌流，B組采用HA-330樹(shù)脂血液灌流。兩組均在內(nèi)科綜合治療基礎(chǔ)上分別在中毒12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行2小時(shí)血液灌流治療。血液凈化治療前、后取靜脈血檢測(cè)IL-6、IL-8、MDA和SOD的含量。結(jié)果B組治療后血清 IL-6下降(9.12±4.98) ng/L，A組下降(6.29±2.17) ng/L，B組IL-6下降較A組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組治療后血清IL-8下降(15.77±17.61) ng/L，A組下降(7.00±2.49) ng/L，B組IL-8下降較A組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組治療后血清MDA下降(1.97±1.07) ng/L，A組下降(1.34±0.62) ng/L，B組MDA下降較A組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組治療后血清 SOD上升(22.44±10.63) ng/L，A組治療后血清SOD上升(14.13±5.28) ng/L，B組SOD上升較A組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論急性百草枯中毒患者采用的HA-330血液灌流器進(jìn)行灌流后對(duì)降低血清中IL-6、IL-8濃度和減輕氧自由基損傷效果明顯優(yōu)于HA-230血液灌流器?？勺鳛閾尵燃毙园俨菘葜卸净颊叩呐R床選擇。

【關(guān)鍵詞】百草枯中毒；血液灌流；細(xì)胞因子；氧自由基

血液灌流(HP)在百草枯中毒的治療中主要通過(guò)擴(kuò)散(diffusion)、對(duì)流(convection)、吸附(adsorption)等機(jī)制起到清除毒物的作用。臨床研究中證實(shí)采用具有炎癥吸附的凈化材料在血液灌流中可以清除致炎/抗炎細(xì)胞因子，這種“非特異性”清除，可弱化炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)程度、減輕炎癥損傷、調(diào)節(jié)致炎/抗炎。有資料證明體外或體內(nèi)的血液灌流均能對(duì)血液中的百草枯有一定的清除作用[5]。本文將血液灌流清除炎性介質(zhì)的功能應(yīng)用于百草枯中毒后炎性介質(zhì)的清除中。觀察不同血液灌流材料對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致細(xì)胞因子的吸附及氧化反應(yīng)損傷的改變，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告于下。

1材料與方法

1.1一般資料選取2012年6月～2013年7月于成都醫(yī)學(xué)院第一醫(yī)院收治的百草枯中毒患者中選取40例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①明確診斷為口服百草枯中毒。②服毒量>5ml。③既往無(wú)心、肝、肺、腎等器官基礎(chǔ)疾病。④百草枯中毒患者入院后給予洗胃、吸附、導(dǎo)瀉、補(bǔ)液、甲強(qiáng)龍、環(huán)磷酰胺等綜合治療。⑤自服毒至首次行血液凈化治療時(shí)間小于12小時(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①混合其他農(nóng)藥或藥物中毒者。②服毒量<5ml者。③既往有心、肝、肺、腎等器官基礎(chǔ)疾病者。④自服毒至首次血液凈化治療時(shí)間由于各種原因?qū)е逻^(guò)長(zhǎng)超過(guò)12小時(shí)者。⑤患者因病情重或其他原因不能完成首次血液凈化治療中途下機(jī)者。將入選的40例患者隨機(jī)分為A、B兩組。A組20例采用HA-230樹(shù)脂血液灌流治療；B組20例采用HA-330 樹(shù)脂血液灌流治療。A組患者男性為11例，女性為9例，年齡22～56歲，平均年齡為25歲，服毒量為50～100ml，服毒至首次血液凈化時(shí)間為4～8小時(shí)；B組患者男性為10例，女性為10例，年齡17～71歲，平均年齡為32歲，服毒量為8～110ml，服毒至首次血液凈化之間為5～12小時(shí)。

1.2治療方法

1.2.1兩組百草枯中毒患者的綜合治療入院前常規(guī)給予1%碳酸氫鈉溶液洗胃，口服蒙脫石散60g，再給予甘露醇導(dǎo)瀉。內(nèi)科治療上給予甲基強(qiáng)的松龍0.5g靜滴1次/12h連續(xù)3天，3天后調(diào)整甲基強(qiáng)的松龍0.5g靜滴1次/日，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺0.5g靜滴1次/日連續(xù)3～5天，維持水電解質(zhì)平衡，清除自由基等藥物治療。

1.2.2分組行血液凈化治療A組患者在綜合治療基礎(chǔ)上，采用HA-230樹(shù)脂血液灌流器進(jìn)行2小時(shí)血流灌注治療。B組采用HA-330樹(shù)脂血液灌流器進(jìn)行2小時(shí)血流灌注治療。

1.2.3標(biāo)本采集血液凈化治療前、后采取靜脈血各5ml置促凝管，所采標(biāo)本在室溫內(nèi)靜置20分鐘后給予4000r/min離心10分鐘，離心后取上層血清置EP管中標(biāo)號(hào)，放于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｓ糜跍y(cè)定血清中IL-6,IL-8及SOD，MDA的含量。

1.2.4檢測(cè)方法采用雙抗體夾心ELISA法。用特異性抗人IL-6或IL-8單克隆抗體包被于酶標(biāo)板上。實(shí)驗(yàn)時(shí)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-6或IL-8會(huì)與包被抗體結(jié)合，洗去游離的成分；加入生物素化的抗人IL-6或IL-8抗體，孵育，再次洗去未結(jié)合的生物素抗體；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，加入顯色底物(TMB)，避光顯色；終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。SOD和MDA加入待測(cè)樣品；每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃恒溫箱溫育；棄去液體并拍干，每孔加洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，反復(fù)洗板5次；每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；加入終止液50μL，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。最后，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中L-6或IL-8，MDA及SOD濃度。

2結(jié)果

2.1兩組患者治療前后血清IL-6和IL-8水平變化A組及B組經(jīng)過(guò)血液灌洗治療后血漿IL-6和IL-8水平均有一定程度下降，但B組下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

Table 1The levels of serum IL-6 and IL-8 concentration in the two groups

組別n時(shí)間 IL-6(ng/L)IL-8(ng/L)A組20治療前26.74±10.5336.60±25.59治療后20.45±9.2016.01±15.70治療前后變化6.29±2.177.00±2.49B組20治療前24.00±13.9736.90±22.31治療后15.02±9.6021.13±9.03治療前后變化9.12±4.98①②15.77±17.61①②

注：與A組治療前后變化比較，①P<0.05；B組IL-6和IL-8組內(nèi)治療前后比較，②P<0.05。

2.2兩組患者治療前后血漿SOD、MDA變化兩組經(jīng)過(guò)治療后血漿MDA水平均有一定下降，但B組下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組經(jīng)過(guò)治療后血漿SOD水平均有升高，但B組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　兩組患者治療前后SOD、MDA水平變化

注：與A組治療前后變化比較， ①P<0.05；B組內(nèi)治療前后比較，②P<0.05

3討論

百草枯(paraquat,PQ)是觸殺性除草劑，為聯(lián)吡啶類(lèi)除草劑，化學(xué)名為1.1-二甲基-4.4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽。百草枯對(duì)人體口服致死量為1～3g[1]，致死濃度為3μg/ml。百草枯經(jīng)胃腸道吸收后約2小時(shí)達(dá)到血漿濃度峰值，其中肺臟、腎臟含量最高，是血漿濃度10～90倍[2]。百草枯中毒死亡率可高達(dá)80%～90%以上。百草枯中毒后的特征性改變是以肺損傷為主,特征性表現(xiàn)為肺間質(zhì)纖維化、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。目前，百草枯的治療尚無(wú)特異性的解毒藥，循證醫(yī)學(xué)證明在常規(guī)清除毒物、大劑量維生素、保肝、利尿等常規(guī)治療前提下，給予大劑量的皮質(zhì)激素能明顯降低病死率，尤其是中毒24h應(yīng)用可有效抑制肺纖維化[3]。并且穩(wěn)定溶酶體膜，減少膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，起到抗肺纖維化作用[4]。因此，阻斷炎性介質(zhì)釋放及膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)百草枯中毒治療有重要的作用。

急性百草枯中毒的機(jī)制包括：氧自由基損傷、過(guò)度炎癥反應(yīng)、鈣超載、酶失衡、細(xì)胞凋亡、DNA 損傷及基因表達(dá)異常等。目前認(rèn)為百草枯中毒主要以百草枯導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)與氧自由基損傷為主。百草枯中毒后可激活粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，合成并釋放大量的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、趨化因子等生物學(xué)效應(yīng)因子，引起明顯的局部、全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)[6]。最近研究證實(shí)[7-8]，百草枯中毒后血液及組織中的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞激活，產(chǎn)生一系列包括IL-1、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)釋放，形成級(jí)聯(lián)的炎癥放大網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞因子激活后誘導(dǎo)發(fā)生SIRS 或MODS的發(fā)生,其血清細(xì)胞因子含量的高低與MODS的發(fā)生及其嚴(yán)重程度有良好的相關(guān)性[9]。百草枯中毒后也可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS 可激活中性粒細(xì)胞核巨噬細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等。并且，ROS可激活 NF-κB 轉(zhuǎn)錄通道，調(diào)控細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)[10]。吳留柱等[11]在百草枯中毒患者血清CRP與IL-6的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后中毒組血漿 CRP 與 IL-6 較對(duì)照組明顯升高，呈時(shí)間依賴(lài)性，兩者顯著相關(guān)，表明中毒后炎癥反應(yīng)引起的SIRS 可能是導(dǎo)致多臟器功能衰竭或死亡的中間過(guò)程。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多臟器功能衰竭是百草枯中毒死亡的主要原因[12-13]，其中炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)是多臟器功能障礙發(fā)病的核心機(jī)制。并且大量炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的SIRS又是加重多臟器功能衰竭的重要原因[14-15]。本研究中A、B組百草枯中毒后IL-6及IL-8細(xì)胞因子水平均有明顯升高，血液凈化后能降低IL-6和IL-8因子的血清濃度，使用HA-330型灌流器的患者血漿中IL-6和IL-8濃度下降更明顯，表明HA-330型灌流器對(duì)百草枯中毒后IL-6，IL-8細(xì)胞因子的吸附作用強(qiáng)于HA-230型灌流器。

目前的研究認(rèn)為氧化還原反應(yīng)在百草枯中毒中也起到重要作用[16]。百草枯中毒后氧化還原反應(yīng)機(jī)制是超氧陰離子的生成可能導(dǎo)致更多的有毒的活性氧自由基形成，如過(guò)氧化氫、羥自由基等。PQ 被攝入到人體后，迅速在肺內(nèi)被肺Ⅰ、Ⅱ型上皮細(xì)胞能夠主動(dòng)攝取，先被 NADPH 還原成 PQ+，而后與氧作用形成超氧陰離子(O2-)，同時(shí)生成 PQ 雙陽(yáng)離子(PQ2+)[17-18]。超氧陰離子在SOD作用下歧化形成過(guò)氧化氫(H2O2)，H2O2透過(guò)細(xì)胞膜，通過(guò) Fenton 型 Haber-Weiss 反應(yīng)形成氧化性更強(qiáng)的羥自由基(OH-)；導(dǎo)致體內(nèi) SOD 大量消耗，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[19-20]。多項(xiàng)研究表明[21]，經(jīng)百草枯處理過(guò)的動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物水平明顯增高。而丙二醛(malondial dehyde，MDA)為病理情況下過(guò)剩的氧自由基攻擊細(xì)胞膜中多聚不飽和脂肪酸，激發(fā)連鎖反應(yīng)，形成一系列脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物。在PQ中毒后，由于機(jī)體出現(xiàn)氧化損傷，大量消耗NADPH、SOD，同時(shí)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過(guò)多，從而導(dǎo)致體內(nèi)SOD下降、MDA增高。在本研究中，選用目前方法較為成熟的SOD、MDA兩項(xiàng)做為過(guò)氧化損傷的指標(biāo)。通過(guò)測(cè)定中毒前、后SOD、MDA變化可以大致反映細(xì)胞清除氧自由基和抗脂質(zhì)氧化損傷的能力。本研究顯示：A、B組中百草枯中毒患者經(jīng)過(guò)血液灌流治療后能明顯升高SOD活力，降低MDA含量。B組的MDA治療前后下降比與A組下降明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組SOD治療前后上升比A組上升明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)表明，使用HA-330型灌流器和HA-230型灌流器血液灌流均可減輕急性百草中毒所致氧自由基損傷，但HA-330型灌流器作用更強(qiáng)。

4結(jié)論

本文資料顯示，對(duì)于急性百草枯中毒患者在內(nèi)科綜合治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用HA-330血液灌流器清除血漿IL-6和IL-8細(xì)胞因子和減輕氧自由基損傷的療效明顯優(yōu)于常規(guī)HA-230血液灌流器的臨床效果。

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基金項(xiàng)目：四川省教育廳基金課題(12ZB208)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 595.4

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.016

(收稿日期：2016-02-07；編輯：陳舟貴)

Different adsorbing materials of hemoperfusion on the effects of IL-6,IL-8 and damage induced by oxygen free radical in serum of patients with acute paraquat poisoning

QIN Ling，HE Feng，WU Weiyu，et al

(The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate different adsorbing materials of hemoperfusion on the effects of IL-6,IL-8 and damage induced by oxygen free radical in serum of patients with acute paraquat poisoning.Methods40 patients with acute paraquat poisoning were randomly assigned to group A and group B,and each group contained 20 cases.HA-230 resin was used in the group A,and HA-330 resin was used in the group B.All patients were given the conventional treatment and hemoperfusion for two hours after poisoning in 12 hours.IL-6,IL8,SOD and MDA in serum before and after the hemoperfusion were measured.ResultsCompared with those in the group A，the levels of IL-6,IL-8 and MDA in the group B were obviously decreased after the hemoperfusion (P<0.05).The activity of plasma SOD in the group B was increased more than that in the group A (P<0.05).ConclusionCompared with HA-230 type hemoperfusion，HA-330 type hemoperfusion not only can effectively reduce the patients serum IL-6 and IL-8,but also decrease the damage induced by the oxygen free radical.

【Key words】Paraquat poisoning；Hemoperfusion；IL-6；IL-8；Oxygen free radical