陳爍 周利武 張雷 趙云龍 楊超 趙建寧*

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 骨科， 江蘇 南京 210002 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院 骨科， 江蘇 南京 210000

緩激肽B2受體(BDKRB2)廣泛分布于人體組織包括關(guān)節(jié)內(nèi)，調(diào)控大部分緩激肽引起的炎癥反應(yīng)[1]。研究報(bào)道BDKRB2基因多態(tài)性與一系列病理狀態(tài)聯(lián)系緊密，如冠心病、糖尿病[2]、肺動(dòng)脈高壓[3]，以及高血壓引起的左心室肥大[4]。盡管BDKRB2在炎癥中的作用已被闡明，但BDKRB2基因多態(tài)性與OA的關(guān)系幾乎未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诿鞔_BDKRB2基因多態(tài)性與OA易感性的關(guān)系，并觀察BDKRB2基因多態(tài)性在OA患者滑膜組織中對(duì)BDKRB2表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)納入對(duì)象為2013年2月至2014年12月我院收治的278名膝關(guān)節(jié)OA患者，以及291名健康受試者作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)取得所有參與人員的知情同意，經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審查通過。膝關(guān)節(jié)OA的診斷采用美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[5]，OA的嚴(yán)重程度采用Kallgren-Lawrence(KL)分級(jí)。實(shí)驗(yàn)組對(duì)象排除其他類型關(guān)節(jié)炎，對(duì)照組對(duì)象無關(guān)節(jié)炎病史，無關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限等關(guān)節(jié)癥狀。統(tǒng)計(jì)所有對(duì)象的風(fēng)險(xiǎn)因素，包括年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、吸煙狀況、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度和運(yùn)動(dòng)情況。將肥胖標(biāo)準(zhǔn)定義為BMI>30。

1.2 BDKRB2基因多態(tài)性分型

用DNA分離試劑盒(Qiagen,Valencia, CA, USA)從外周血提取DNA100 ng，25 μL反應(yīng)緩沖液內(nèi)含0.2 mmol/L堿磷酸脫氧核苷酸，1.0 mmol/LMgCl2，20 mmol/LTris/Cl(pH=8.4),50mmol/L KCl，0.015 nmmol/L正反向引物和0.5UTaq聚合酶(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性1 min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括60℃(+9/-9)或者57℃(C -58T)退火30 s、72℃延伸10 s、最后在G-Storm熱循環(huán)中72℃延伸5 min。BDKRB2+9/-9多態(tài)性引物序列為：正5-TCCAGCTCTGGCTTCTGG-3；反5-AGTCGCTCCC TGGTACTGC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為80bp(-9)與89bp(+9)。BDKRB2 C -58T多態(tài)性簡(jiǎn)并引物序列為：正 5-AAGGTGGCCGCAGCCTTCC-3；反5-AGTCGCT CCCTGGTACTGC-3[6]。反向引物包含一處G-C顛換，產(chǎn)生限制性核酸內(nèi)切酶Bfa的識(shí)別位點(diǎn)(5-CTAG-3)，在C等位基因存在時(shí)，將133bpPCR產(chǎn)物分解成112+21bp。用電泳將所有PCR產(chǎn)物根據(jù)大小進(jìn)行分離，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為1×Tris-硼酸，溴乙錠染色，紫外燈下觀察鑒定基因型。等位基因和基因型頻率用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR

從156個(gè)接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)的OA病人中獲取滑膜組織，從滑膜組織中提取的RNA用SuperScript First-Strand cDNA合成試劑盒(Invitrogen, Grand Island NY, USA)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，基因表達(dá)使用PrimeTime Mini qPCR Assays (Integrated DNA Technologies, Iowa, USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定。PCR反應(yīng)根據(jù)說明在ABI PRISM 7900HT測(cè)序系統(tǒng) (Applied Biosystems)中進(jìn)行。BDKRB2的表達(dá)與3個(gè)管家基因HPRT1, GAPDH 和18S的平均表達(dá)作比較：對(duì)每一個(gè)cDNA樣本作3次重復(fù)，然后對(duì)18S (n=3)，GAPDH(n=3) 和 HPRT1 (n=3), 與BDKRB2 (n=3)一起進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。3個(gè)管家基因Ct的平均值(3x3)作為對(duì)照與BDKRB2進(jìn)行對(duì)比。BDKRB2相對(duì)于管家基因的的表達(dá)用2-ΔCt的方法來表示。用秩和檢驗(yàn)評(píng)價(jià)+9/-9和-58C/T基因型的BDKRB2的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有引物和探針序列見表1。

表1 BDKRB2定量PCR中各基因引物序列和探針Table 1 The primers for quantitative PCR analysis of BDKRB2

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

從滑膜組織中提取的蛋白使用SDS-PAGE電泳，分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜的方法轉(zhuǎn)至PVDF膜上(Millipore, Bedford MA, USA)。膜上的非特異性蛋白使用含0.1%Tween，5%無脂牛奶的PBS20 mL封閉1 h，然后與兔抗人BDKRB2-抗(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)進(jìn)行孵育，然后與合適的能與HRP免疫性結(jié)合的二抗進(jìn)行孵育(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)。免疫結(jié)合的蛋白使用增強(qiáng)化學(xué)熒光(ECL)試劑(Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA)處理后進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

χ2檢驗(yàn)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的基因型頻率和人口分布，如各SNP均與OA獨(dú)立相關(guān)則用多元邏輯回歸分析模型評(píng)價(jià)。計(jì)算比值比(ORs)和95%可信區(qū)間，用SPSS19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 參與者特性

OA患者的BMI明顯高于對(duì)照組(P=0.001)，但在其他人口學(xué)特征和臨床特征方面，如性別、年齡、吸煙狀態(tài)、體力勞動(dòng)情況等，并無明顯差異(表2)。

2.2 -9/-9基因型患OA風(fēng)險(xiǎn)更高

OA組和對(duì)照組中BDKRB2基因多態(tài)性的基因型分布和等位基因頻率如表3所示。所有多態(tài)性的基因型頻率分布符合哈-溫平衡(P>0.05)。BDKRB2 -58T/C基因型和等位基因頻率在OA組和對(duì)照組無明顯差異。但是OA組中-9/-9基因型明顯高于對(duì)照組(33.46% vs 20.07%)，同時(shí)OA組中-9等位基因頻率也明顯高于對(duì)照組(57.754% vs 47.34%,P<0.001)。邏輯回歸分析顯示，經(jīng)過性別、年齡、BMI、吸煙狀況、家族史和勞動(dòng)情況等變量調(diào)整后，-9/-9基因型相對(duì)于+9/+9基因型患OA的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高(OR=2.35，95% CI: 1.409～3.937，P<0.001)。調(diào)整后-9等位基因的比值比(OR)顯著高于+9等位基因(OR=1.52, 95% CI: 1.186～1.947,P<0.001)。

表2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象的人口學(xué)特點(diǎn)和臨床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of all subjects in the study

注：OA：骨關(guān)節(jié)炎；KL：Kallgren-Lawrence；ns：無顯著差異；*：有顯著差異

表3 BDKRB2基因型分布和等位基因頻率Table 3 Genotype distribution and allele frequency of BDKRB2 polymorphism in OA and control subjects

注：OA：骨關(guān)節(jié)炎；OR：比值比

2.3 -9等位基因患嚴(yán)重OA風(fēng)險(xiǎn)更高

用KL分型將OA患者分為KL評(píng)分≤3和>3兩組，分析兩組間基因型和放射學(xué)分型的差異(表4)。研究發(fā)現(xiàn)+9/+9基因型在KL評(píng)分≤3和KL評(píng)分>3兩組間差異明顯(P< 0.001)。+9/-9和-9/-9基因型患嚴(yán)重OA(KL評(píng)分>3)的風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=2.825,P=0.003，和OR=2.94,P=0.004)。因此-9基因型患嚴(yán)重OA風(fēng)險(xiǎn)更高(OR=1.545,，P=0.011)。-58T/C在兩組間無明顯差異。

表4 OA患者BDKRB2基因多態(tài)性和放射學(xué)分級(jí)Table 4 The BDKRB2 polymorphisms and the radiographic severity of OA patients

圖1 不同KL分級(jí)的OA患者滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平n為各分組中患者數(shù)量，水平線代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用秩和檢驗(yàn)計(jì)算P值 Fig.1 The BDKRB2 mRNA level in synovial tissues from patients with OA according to Kellgren-Lawrence (KL) grade. n is the number of patients studied in each group. The horizontal lines in each plot represent the mean and the standard deviation (SD) of the mean. P-values were calculated using a Kruskal-Wallis test

2.4 BDKRB2 mRNA和蛋白質(zhì)水平

實(shí)驗(yàn)表明滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平與OA的放射學(xué)分級(jí)相關(guān)(圖1)。KL4級(jí)患者的BDKRB2 mRNA平均水平(2.502±1.319)明顯高于KL3級(jí)和2級(jí)患者(1.471±1.002 or 1.895±1.174,P<0.001)。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)BDKRB2基因多態(tài)性基因型的不同，研究滑膜組織BDKRB2 mRNA水平。研究發(fā)現(xiàn)+9/+9基因型滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平明顯低于+9/-9和-9/-9基因型(0.723 ±0.357 vs. 2.128 ±1.196和2.486 ±1.203，P<0.001)。而-58T/C基因多態(tài)性并不影響滑膜組織BDKRB2 mRNA水平(圖2)。Western blot顯示-58TT、-58TC和-58CC三種基因型滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平無明顯差異，而+9/-9和-9/-9基因型滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平明顯高于+9/+9基因型(圖3)。

圖2 不同BDKRB2基因型的OA患者滑膜組織中BDKRB2 mRNA水平n為各分組中患者數(shù)量，水平線代表平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用秩和檢驗(yàn)計(jì)算P值 Fig.2 The BDKRB2 mRNA level in synovial tissue from patients with OA according to the genotypes of the BDKRB2 gene polymorphism. n is the number of patients studied for each group. The horizontal lines in each plot represent the mean and the standard deviation (SD) of the mean. P-values were calculated using a Kruskal-Wallis test

圖3 用免疫印跡分析檢測(cè)不同基因型OA患者滑膜組織中BDKRB2蛋白水平上圖為不同基因型OA患者滑膜組織中BDKRB2抗體的免疫印跡分析結(jié)果；下圖為BDKRB2/GAPDH比值的密度計(jì)分析，GAPDH作為加載控制器，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示Fig.3 The BDKRB2 protein level in synovial tissue from different genotype carriers by Western blotting analysis. The above panel shows representative Western blotting of BDKRB2 antibodies in the synovial tissue from different genotype carriers. The under panel shows densitometric analysis of BDKRB2/GAPDH ratio. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a loading control. The data are presented as mean ±SD

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是關(guān)節(jié)炎中最常見的一種類型，是一種慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)內(nèi)所有結(jié)構(gòu)包括骨、軟骨和滑膜等，其中最主要的特征是軟骨退變[8,9]。流行病學(xué)研究證明多個(gè)危險(xiǎn)因素與OA的易感性有關(guān)，但誘發(fā)OA的具體機(jī)制尚不清楚。研究表明年齡、創(chuàng)傷、激素和機(jī)械因素均與OA的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[10]。除了上述傳統(tǒng)的發(fā)病誘因，有研究提示某些基因多態(tài)性也和OA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[11-13]。據(jù)報(bào)道在膝關(guān)節(jié)OA患者中應(yīng)用緩激肽B2受體拮抗劑能產(chǎn)生持久的鎮(zhèn)痛效果，提示緩激肽可能在OA發(fā)展中有重要作用[14]。

近年來大量研究顯示，緩激肽(BK)在多種生理狀況中有重要的調(diào)節(jié)作用，如炎癥、血管通透性、高血壓、水腫、平滑肌收縮和糖穩(wěn)態(tài)[15,16]。眾所周知BK絕大多數(shù)生理學(xué)效應(yīng)是由BDKRB2介導(dǎo)[15]，而BDKRB2存在于絕大多數(shù)組織，通過提高NO的生成和釋放調(diào)節(jié)血管舒張和炎癥反應(yīng)[17, 18]。BDKRB2在BK生理效應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，而目前關(guān)于BDKRB2遺傳多樣性對(duì)OA發(fā)病機(jī)制的影響尚屬空白。

本研究分析了中國(guó)人群中BDKRB2基因多態(tài)性對(duì)OA易感性和嚴(yán)重程度的影響。人類的BDKRB2基因位于染色體14q32[19]，基因含有數(shù)個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，在基因的第一個(gè)外顯子有9個(gè)堿基對(duì)的插入點(diǎn)/缺失點(diǎn)(+9/-9，rs5810761)，啟動(dòng)子區(qū)有C-T轉(zhuǎn)換點(diǎn)(C -58T，rs1799722)[20]。相比-58T/C多態(tài)性，+9/-9多態(tài)性不僅與OA患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而且能影響罹患OA的嚴(yán)重程度。

研究結(jié)果表明，+9/-9和-9/-9基因多態(tài)性的患者罹患嚴(yán)重OA的風(fēng)險(xiǎn)較高。此外，BDKRB2多態(tài)性-9等位基因與滑膜組織中BDKRB2 mRNA和相關(guān)蛋白的高表達(dá)有關(guān)[21]。BDKRB2基因多態(tài)性與OA易感性和嚴(yán)重程度得到進(jìn)一步驗(yàn)證。