高　原　王　哲　陳　奇　王　瑩　井　歡　潘　茜　于　丹　劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧　沈陽　110847)

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·基礎(chǔ)研究·

補中益氣湯對肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株與順鉑敏感細(xì)胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表達(dá)的影響

高原王哲陳奇1王瑩井歡潘茜于丹劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的探討補中益氣湯對肺腺癌順鉑(DDP)耐藥與敏感細(xì)胞株荷瘤BALB/c小鼠移植瘤P-gp蛋白表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP及敏感細(xì)胞株A549，接種于BALB/c小鼠腋窩皮下，荷瘤成功后給予順鉑或順鉑聯(lián)合低、中、高劑量補中益氣湯治療。實驗共分為10組：A549/DDP或A549荷瘤對照組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+低劑量補中益氣湯組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+中劑量補中益氣湯組、A549/DDP或A549荷瘤+順鉑+高劑量補中益氣湯組。給藥結(jié)束后，測量移植瘤體積并計算藥物抑瘤率及抑瘤作用提高率，蛋白質(zhì)印跡法檢測移植瘤組織P-gp蛋白的表達(dá)。結(jié)果順鉑對A549/DDP移植瘤體積無顯著影響(P>0.05)，而使A549移植瘤體積顯著縮小(P<0.05)；聯(lián)合低、中、高劑量補中益氣湯的A549/DDP及A549移植瘤體積均縮小(P<0.05)，抑瘤率均增加(P<0.05)，隨著中藥劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加；單獨順鉑可上調(diào)A549/DDP移植瘤組織中P-gp蛋白表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達(dá)(P<0.05)；聯(lián)合低劑量補中益氣湯并未顯著下調(diào)A549/DDP及A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達(dá)(P>0.05)；聯(lián)合中、高劑量補中益氣湯的A549/DDP及A549移植瘤組織中P-gp蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，兩劑量間無差異(P>0.05)。結(jié)論在順鉑耐藥與順鉑敏感的肺腺癌移植瘤組織中，補中益氣湯均有縮小移植瘤體積、提高順鉑抑瘤率、下調(diào)P-gp蛋白表達(dá)的作用，尤以中、高劑量作用最顯著。

〔關(guān)鍵詞〕補中益氣湯；肺腺癌；順鉑；耐藥

腺癌臨床發(fā)病時多已發(fā)生淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，喪失了最佳手術(shù)時機(jī)，治療多以化學(xué)治療為主。肺腺癌一線治療以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案為首選，但越來越多的患者表現(xiàn)出對鉑類藥物耐藥，這種耐藥性還造成了患者對放療或其他不同藥理機(jī)制化學(xué)藥物的敏感性降低〔1〕，嚴(yán)重影響了肺腺癌的臨床療效。補中益氣湯治療晚期肺癌〔2，3〕具有補益肺氣之功效，可以改善肺癌晚期患者長期化療后常出現(xiàn)的面色萎黃、少氣懶言、惡心嘔吐、納呆食少、神疲乏力等脾胃虛弱、氣血不足的癥狀。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補中益氣湯含藥血清能干擾人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的生長作用并逆轉(zhuǎn)其耐順鉑(DDP)作用〔4，5〕，但補中益氣在肺癌DDP耐藥形成過程中的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究以A549/DDP與DDP敏感細(xì)胞株A549荷瘤BALB/C小鼠為研究對象，檢測補中益氣湯對耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株及動物A549/DDP及A549細(xì)胞株均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究中心。BALB/c 小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SPF級，6周齡，雄性，體重(18±2)g，動物許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.2中藥及制備補中益氣湯根據(jù)新世紀(jì)版《方劑學(xué)》(中國中醫(yī)藥出版社，鄧中甲主編)中規(guī)定用藥及臨床常用劑量(黃芪18 g，甘草9 g，人參6 g，當(dāng)歸3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術(shù)9 g)，全部藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室鑒定，加水浸泡30 min后按湯劑常規(guī)方法煎熬，過濾并濃縮成生藥含量為1 g/ml的藥液，冷卻后4℃保存。

1.3試劑DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國HyClone公司；DDP購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；P-gp兔抗鼠多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；β-actin兔抗鼠多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液均購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.4移植瘤動物模型的制備在 37℃、5% CO2的孵育條件下，A549、A549/DDP細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分別將收集好的對數(shù)生長期的A549/DDP和A549細(xì)胞株，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/ml，按相應(yīng)分組接種0.2 ml腫瘤細(xì)胞于裸鼠腋窩皮下。接種腫瘤細(xì)胞8 d后成瘤，表明移植瘤動物模型的制備成功。

1.5實驗分組及給藥60只BALB/c 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，按隨機(jī)數(shù)字表法分為10組，A組(A549/DDP荷瘤對照組)、B組(A549/DDP荷瘤+DDP)、C組(A549/DDP荷瘤+DDP+低劑量補中益氣湯)、D組(A549/DDP荷瘤+DDP+中劑量補中益氣湯)、E組(A549/DDP荷瘤+DDP+高劑量補中益氣湯)、a組(A549荷瘤對照組)、b組(A549荷瘤+DDP)、c組(A549荷瘤+DDP+低劑量補中益氣湯)、d組(A549荷瘤+DDP+中劑量補中益氣湯)、e組(A549荷瘤+DDP+高劑量補中益氣湯)，每組6只。按照“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出裸鼠等效劑量，設(shè)三個生藥劑量5.82(高劑量)、2.91(中劑量)、1.46 g/kg(低劑量)，接種瘤細(xì)胞第9天開始給予不同藥物干預(yù)。A組、a組蒸餾水灌胃，1 ml/只，2次/d；B組、b組10 mg/kg DDP腹腔注射，2次/d；C組、c 組低劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2 次/d；D組、d組中劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2次/d；E組、e組高劑量補中益氣湯灌胃1 ml/只，2次/d，同時10 mg/kg DDP腹腔注射，2 次/d。給藥25 d后，處死全部BALB/c小鼠。無菌剝?nèi)∫浦擦?，測量皮下移植瘤的最大長徑(a)和橫徑(b)，計算移植瘤體積：移植瘤體積=a×b2/2；計算各組藥物的抑瘤率：抑瘤率=(對照組瘤質(zhì)量-藥物組瘤質(zhì)量)/對照組瘤質(zhì)量× 100%；抑瘤作用提高率(%)=(藥物組抑瘤率-對照組抑瘤率)/對照組抑瘤率×100%。

1.6移植瘤中P-gp蛋白的檢測采用蛋白質(zhì)印跡法：提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度；灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠；等量的細(xì)胞蛋白提取物通過SDS-PAGE電泳分離；轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；將膜置于脫脂牛奶中封閉2 h；孵育一抗工作液(1∶400)，4℃過夜；室溫下孵育二抗工作液(1∶5 000)2 h；在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液；用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)采集目的條帶，分析其光密度值(OD)。實驗結(jié)果用蛋白相對表達(dá)量表示，蛋白相對表達(dá)量=(待測組OD P-gp/待測組OD β-actin)/(對照組OD P-gp/對照組OD β-actin)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、SNK法或秩和檢驗。

2結(jié)果

2.1BALB/c小鼠的一般狀態(tài)及致瘤率各組BALB/c小鼠荷瘤后活動良好，未出現(xiàn)明顯的拒食、躁動、便溏等癥狀。荷瘤8 d后，各組BALB/c小鼠均有腫瘤結(jié)節(jié)生長，瘤塊直徑達(dá)到2～3 mm，經(jīng)病理學(xué)診斷符合肺腺癌組織學(xué)特征。各組BALB/c小鼠致瘤率均達(dá)到100%。

2.2各組BALB/c小鼠移植瘤體積及藥物的抑瘤率接種A549/DDP細(xì)胞的各組BALB/c小鼠，單獨DDP干預(yù)后移植瘤體積輕度縮小，但與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但聯(lián)合低、中、高劑量的補中益氣湯后移植瘤體積均顯著縮小，與對照組、DDP組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，DDP抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加。見表1。

如表2所示，接種A549細(xì)胞的各組BALB/c小鼠，單獨DDP干預(yù)后移植瘤體積就已顯著縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合低、中、高劑量的補中益氣湯后移植瘤體積進(jìn)一步縮小，與對照組、DDP組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，隨著補中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積隨之縮小，DDP抑瘤率隨之增加，抑瘤作用提高率也隨之增加。

表1　A549/DDP細(xì)胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積及藥物抑瘤率

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

表2　A549細(xì)胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤體積及藥物抑瘤率

與a組比較：1)P<0.05；與b組比較：2)P<0.05

2.3各組BALB/c小鼠移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(dá)A～E組中，單獨DDP干預(yù)后移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(dá)(2.03±0.04)明顯上調(diào)，與對照組(設(shè)為1)比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)合低劑量補中益氣湯并未進(jìn)一步下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)水平(1.62±0.03)，與DDP組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；聯(lián)合中、高劑量補中益氣湯均可以顯著下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)(1.18±0.05,1.30±0.01,P<0.05)，但兩種劑量之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。a～e組中，單獨DDP干預(yù)后移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(dá)(0.66±0.12)明顯下調(diào)，與對照組(設(shè)為1)比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)合低劑量補中益氣湯并未進(jìn)一步下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)水平(0.61±0.03)，與順鉑組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；聯(lián)合中、高劑量補中益氣湯可以進(jìn)一步下調(diào)P-gp的表達(dá)(0.52±0.05,0.47±0.01,P<0.05)，但兩種劑量之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖1，圖2。

圖1　A549/DDP細(xì)胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(dá)

圖2　A549細(xì)胞荷瘤BALB/c小鼠各組移植瘤組織中P-gp蛋白的表達(dá)

3討論

補中益氣湯為金元時期著名醫(yī)家李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》的經(jīng)典方，該方中重用黃芪，補中益氣、升陽固表；人參、白術(shù)、甘草甘溫益氣、健脾益胃；橘皮理氣行滯；當(dāng)歸補血和營；升麻、柴胡協(xié)同黃芪、人參以升舉清陽之氣，全方健脾胃以治氣虛之本，升提下陷陽氣，以達(dá)培土生金之效。臨床研究表明，補中益氣湯聯(lián)合化療治療晚期肺癌，可有效提高患者生存質(zhì)量、延長生存期，減輕化療引起的毒副反應(yīng)，有效改善肺癌耐藥，提高肺癌臨床療效〔6，7〕。A549/DDP細(xì)胞為A549細(xì)胞經(jīng)過長期耐藥篩選后獲得的耐藥株，其耐藥性質(zhì)穩(wěn)定，培養(yǎng)液中即使不加入DDP，其耐藥性變化不明顯，適合用于DDP耐藥與DDP敏感腫瘤組織的比較研究。兩種腫瘤細(xì)胞株均在接種8 d后成瘤，但在持續(xù)的DDP治療后，移植瘤的體積出現(xiàn)了不同的變化，A549/DDP移植瘤體積無變化，而A549移植瘤體積縮小。聯(lián)合補中益氣湯后，兩種移植瘤的體積均顯著縮小，與劑量呈正相關(guān)。進(jìn)一步證實補中益氣湯對DDP耐藥與DDP敏感的腫瘤病灶均有縮小作用。P-gp是一種跨膜糖蛋白，主要分布于細(xì)胞膜上，其耐藥機(jī)制有賴于ATP的調(diào)節(jié)，P-gp與化療藥物結(jié)合后，能夠通過與ATP 結(jié)合并利用ATP提供的能量將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物逆濃度梯度泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物處于無效的低濃度狀態(tài)，不能有效殺傷癌細(xì)胞，最終導(dǎo)致多藥耐藥(MDR)。早有臨床報道〔8〕，肺腺癌組織中P-gp表達(dá)率較高，與其他肺癌病理類型有顯著性差異，證實P-gp表達(dá)參與了肺腺癌多藥耐藥的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，DDP治療后，A549/DDP移植瘤組織中P-gp蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而A549移植瘤組織中P-gp表達(dá)顯著下調(diào)，說明DDP可使耐藥腫瘤組織藥物泵增多從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，而可使敏感腫瘤組織中藥物泵減少從而發(fā)揮化療藥物的作用。在耐藥腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯可使DDP所致上調(diào)的P-gp蛋白水平下調(diào)；而在敏感腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯可使DDP所致下調(diào)的P-gp蛋白水平進(jìn)一步下調(diào)。說明無論在DDP耐藥還是DDP敏感腫瘤組織中，中、高劑量補中益氣湯均可使藥物泵數(shù)量減少，從而增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)DDP濃度，更有效地發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。本實驗結(jié)果揭示補中益氣湯可以下調(diào)DDP耐藥與DDP敏感腫瘤組織中P-gp的表達(dá)，證實該復(fù)合方藥可以通過抑制化療藥物泵的表達(dá)來干預(yù)肺癌DDP耐藥。

4參考文獻(xiàn)

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8左云，黃建安，穆傳勇，等.耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP、LRP及其表達(dá)產(chǎn)物P-gp、MRP、LRP在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2006;11(12)：921-8.

〔2015-12-17修回〕

(編輯郭菁)

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No.81403303)；中國博士后科學(xué)基金面上資助項目(No.2014M551122)；中國博士后科學(xué)基金特別資助項目(No.2015T80266)；遼寧省自然科學(xué)基金項目(No.2013020178)

通訊作者：劉春英(1962-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥治療腫瘤機(jī)制的研究。

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3089-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.001

Effect of Buzhong Yiqi decoction on the P-gp expression in transplantation tumor of BALB/c mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells and cisplatin-sensitive cells

GAO Yuan, WANG Zhe, CHEN Qi,et al.

Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of Buzhong Yiqi decoction on P-gp expression in transplantation tumor of BALB/C mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells (A549/DDP) and cisplatin-sensitive cells (A549).MethodsThe lung tumor-bearing model was established by inoculation of A549/DDP cells and A549 cells into BALB/c mice subcutaneously. All the mice were randomly divided into A549/DDP or A549 bearing model, A549/DDP or A549 bearing model with DDP, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and low dose of Buzhong Yiqi decoction, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and medium dose of Buzhong Yiqi decoction, A549/DDP or A549 bearing model with DDP and high dose of Buzhong Yiqi decoction groups. Volume of transplantation tumor was measured. Tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate were calculated. Western blot was used to detect expression of P-gp protein.ResultsDDP reduced the volume of transplantation tumor with A549 cells (P<0.05), however it did not reduce the volume of transplantation tumor with A549/DDP cells. Low, medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor with A549/DDP cells and A549 cells, increased the tumor inhibitory rate (P<0.05). With the increasing concentration of Buzhong Yiqi decoction, the volume of transplantation was smaller, and the tumor inhibitory rate and the tumor inhibitory increasing rate were higher. DDP up-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549/DDP cells, however it down-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549 cells (P<0.05). Medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction down-regulated P-gp protein expression of transplantation tumor with A549/DDP and A549 cells (P<0.05).ConclusionsIn the cisplatin-resistant and -sensitive lung tumor tissues, Buzhong Yiqi decoction reduces the volume of transplantation tumor, higher the tumor inhibitory rate, and down-regulats P-gp protein expression.

【Key words】Buzhong Yiqi decoction; Lung adenocarcinoma;Cisplatin; Drug resistance

1遼寧省體育科學(xué)研究所生理研究室

第一作者：高原(1980-)，女，博士，副教授，主要從事中藥調(diào)節(jié)腫瘤耐藥作用及其機(jī)制的研究。