郭洪娜

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東 沂水　276400)

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結(jié)核分枝桿菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

郭洪娜

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東 沂水276400)

摘要：目的探討結(jié)核分枝桿菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在結(jié)核病血清學(xué)中的診斷價(jià)值。方法以痰涂片、痰培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)試劑盒作為對(duì)照，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence immunoassay，CLEIA)檢測(cè)結(jié)核病組、非結(jié)核呼吸系病組、健康對(duì)照組血清標(biāo)本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平，評(píng)價(jià)其在結(jié)核病血清學(xué)中的診斷價(jià)值。結(jié)果①肺結(jié)核病組38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗體水平(143621.0±23231.7，179731.1±16342.1)明顯高于非結(jié)核呼吸疾病組(27417.5±2371.8，32066.2±3310.9)和健康對(duì)照組(35262.9±5764.2，22765.5±3695.7)，(P<0.05)。②38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c檢測(cè)抗結(jié)核抗體的敏感度(69.0%，72.0%)、高于痰培養(yǎng)(21.0%)、38 kD(20.0%)、16 kD試劑盒(26.0%)，(P<0.05)。③38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c檢測(cè)抗結(jié)核抗體的特異度(85.4%，83.8%)高于38kD(61.1%)、16kD試劑盒(50.0%)，(P<0.05)。④聯(lián)合應(yīng)用38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c融合抗原檢測(cè)抗結(jié)核抗體的敏感度為89.0%，明顯高于38kD- Rv1419(69.0%)、16kD- Rv2041c(72.0%)，(P<0.05)。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在結(jié)核病的血清學(xué)診斷上均具有較高的敏感度和特異度，其聯(lián)合應(yīng)用，能夠提高抗結(jié)核抗體檢測(cè)的敏感度。

關(guān)鍵詞：38kD-Rv1491；16kD-Rv2041c；化學(xué)發(fā)光酶免疫法；血清學(xué)診斷

目前世界上現(xiàn)存的傳染病中，結(jié)核病(tuberculosis，TB)的傳播流行是非常廣泛、嚴(yán)重的，并且嚴(yán)重危害著人民群眾的身體健康，導(dǎo)致罹患傳染病的人群致殘、致死[1]。目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法有細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等，其中血清學(xué)診斷因所需的費(fèi)用低、實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單而占有重要的地位，但也有不足之處：特異性抗體的檢測(cè)敏感度不高，一種抗原只能檢出部分結(jié)核感染者，用單個(gè)抗原進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果遠(yuǎn)不能滿足臨床工作的需求等。所以多個(gè)抗原融合或者聯(lián)合應(yīng)用就成了今后血清學(xué)診斷的主要研究方向。在本研究中應(yīng)用化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測(cè)230份血清標(biāo)本中抗38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗體水平，為結(jié)核病血清學(xué)診斷提供更好的抗原選擇。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象(1)肺結(jié)核病組：2012年9月至2015年4月在沂水中心醫(yī)院傳染病科治療的100例患者，全部按照結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]確診為肺結(jié)核，其中52例男性，48例女性，平均年齡為(42±12)歲。(2)非結(jié)核呼吸疾病組：同期在呼吸內(nèi)科治療的90例非結(jié)核呼吸疾病患者，排除肺結(jié)核，46例男性，44例女性，平均年齡(38±20)歲。(3)健康對(duì)照組：40例健康體檢者均來源于同期在體檢中心查體的人員，無結(jié)核病感染史，無呼吸道疾病。22例男性，18例女性，平均年齡為(39±15)歲。

1.1.2主要試劑與儀器38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；16kD、38kD、16kD+38kD結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒分別購自于廣州建侖、南京大淵、上海奧普生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；化學(xué)發(fā)光儀為北京科美東雅發(fā)展有限公司；BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀為BD公司。

1.2方法

1.2.1痰涂片和痰培養(yǎng)嚴(yán)格按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行操作。

1.2.2用38kD、38kD+16kD、16kD試劑盒(膠體金法)檢測(cè)肺結(jié)核病組、非結(jié)核呼吸疾病組血清標(biāo)本中的抗結(jié)核抗體，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.2.3抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平檢測(cè)(1)包被抗原：用抗原包被液將38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c分別稀釋至12.5、6.25μg/ml，每孔加樣100 μl，留空白對(duì)照孔(只加抗原包被液)，振蕩混勻，置4℃過夜。(2)洗板： 5次，每次5min。(3)封閉：每孔加150 μl封閉液混勻，37℃溫育60 min；(4)洗板： 5次，每次5min。(5)加待檢樣品：每孔加100 μl用封閉液按1∶20稀釋的血清標(biāo)本，混勻，37℃溫育60 min。每個(gè)樣本做2個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)空白、陰性及陽性對(duì)照，空白孔內(nèi)只加抗原包被液；陰性孔內(nèi)加確診為非結(jié)核呼吸疾病患者血清，陽性孔內(nèi)加38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原陽性的血清標(biāo)本。(6 )洗板：5次，每次5min。(7)加入羊抗人IgG：將HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體用封閉液稀釋至1∶10000，混勻，每孔加樣100μl，37℃溫育60 min。(8)洗板：5次，每次5min。(9)加入底物液：每孔加100 μl新鮮配制的底物溶液，立即放入化學(xué)發(fā)光儀。(10)測(cè)定發(fā)光值：將反應(yīng)完全的酶標(biāo)板放入發(fā)光儀中，讀取發(fā)光值，取兩孔平均值作為最終結(jié)果。(11) 繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC曲線)。

1.3敏感度與特異度的計(jì)算公式敏感度=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%。特異度=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%

2結(jié)果

2.1各組血清標(biāo)本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平見表1。肺結(jié)核病組38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平明顯高于非結(jié)核呼吸疾病組和健康對(duì)照組，P<0.05；健康對(duì)照組與非結(jié)核呼吸疾病組相比較無明顯差異，P>0.05。

表1　各組血清標(biāo)本中抗38kD- Rv1419，

2.238kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的ROC曲線分析見表2，圖1，圖2。

38kD-Rv1419抗體的ROC曲線下面積為0.842，把特異度為90%時(shí)的抗38kD- Rv1419抗體的化學(xué)發(fā)光值69000作為結(jié)核病診斷的臨界值，100例肺結(jié)核病患者中69例陽性，敏感度為69.0% (69/100)；90例非結(jié)核呼吸疾病患者中13例陽性，特異度為85.6% (77/90)。40例健康者中陽性6例，特異度為85.0% (34/40)?？偺禺惗葹?5.4% (111/130)。

16kD- Rv2041c抗體的ROC曲線下面積為0.857，以特異度為90%時(shí)的抗16kD- Rv2041c抗體的化學(xué)發(fā)光值49000為診斷結(jié)核病的臨界值，100例肺結(jié)核病患者中，72例陽性，敏感度為72.0%(72/100)；90例非結(jié)核呼吸疾病患者中，16例陽性，特異度為82.2%(74/90)。40例健康者中5例陽性，特異度為87.5%(35/40)。總特異度為83.8%(109/130)。

表2　抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體ROC曲線分析表

95%可信區(qū)間均未包含0，曲線下面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖1　抗原38kD- Rv1419CLEIA檢測(cè)的ROC曲線圖

圖2　抗原16kD- Rv2041cCLEIA檢測(cè)的ROC曲線圖

2.3338kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的測(cè)定和痰涂片、痰培養(yǎng)及38kD、38kD+16kD、16kD 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較，見表3。100例肺結(jié)核的患者中，38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c檢測(cè)的敏感度明顯高于痰培養(yǎng)法、38kD試劑盒和16kD試劑盒，P<0.05；與38kD+16kD試劑盒比較差無明顯異，P>0.05。90例非結(jié)核的呼吸疾病患者中，檢測(cè)的特異度明顯高于38kD試劑盒和16kD試劑盒，P<0.05；與38kD+16kD試劑盒比較，無明顯差異，P>0.05。

2.438kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯(lián)合檢測(cè)的臨床價(jià)值見表4。將38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c兩種抗原聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)，其在診斷結(jié)核病上的敏感度為89.0%(89/100)，明顯高于38kD- Rv1419(69.0%，69/100)、16kD- Rv2041c(72.0%，72/100)，P<0.01。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)的特異度為82.3%(107/130)，與38kD- Rv1419(85.4%, 111/130)、16kD- Rv2041c(83.8%, 109/130)相比，無顯著差異，P>0.05。從而可以看出這兩個(gè)抗原聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯提高結(jié)核抗體檢測(cè)的敏感度，而對(duì)特異度沒有影響。

表3　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c和痰涂片、痰培養(yǎng)及試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較

表4　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯(lián)合檢測(cè)的臨床價(jià)值

3討論

結(jié)核病的臨床診斷由于結(jié)核抗原多而復(fù)雜，所以結(jié)核病患者的抗體譜也呈現(xiàn)多樣性。Alito等[3]用10種重組結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原檢測(cè)結(jié)核患者血清中的特異性結(jié)核抗體，結(jié)果顯示近90%的患者血清中至少存在一種結(jié)核抗體，抗體在體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類及水平可以隨患者的免疫背景、疾病的不同階段以及結(jié)核分枝桿菌菌株的不同而不同[4]。結(jié)核病患者的抗體反應(yīng)是針對(duì)多種結(jié)核抗原的，任何一種抗原都無法檢測(cè)結(jié)核病患者血清中所有的結(jié)核抗體，因此應(yīng)用多種抗原進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高診斷的敏感性[5]。

38kD蛋白為結(jié)核分枝桿菌特異抗原，可引起機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫，是主要免疫原，用于結(jié)核病血清學(xué)診斷，檢測(cè)的敏感度和特異度均較高，是迄今為止作為單項(xiàng)診斷結(jié)核最好的抗原，也是目前商品化試劑盒中使用最廣泛的抗原之一。研究報(bào)道該抗原檢測(cè)的敏感度為16% ～80%[6]。Rv1419是一個(gè)T細(xì)胞抗原，有較好的免疫原性，可刺激單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-γ。在本研究中我們把38 kD、Rv1419這兩種蛋白進(jìn)行融合，形成了新的蛋白抗原，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的敏感度和特異度分別為69.0%、85.4%，均高于單個(gè)抗原檢測(cè)，可以作為結(jié)核病血清學(xué)診斷的備選抗原之一。

很多研究表明，16kD抗原是一種不管在結(jié)核分枝桿菌穩(wěn)定生長(zhǎng)期還是在缺氧期都占優(yōu)勢(shì)的蛋白[7]。有關(guān)學(xué)者[8]通過研究發(fā)現(xiàn)16kD抗原可以在結(jié)核病發(fā)病早期就能夠檢測(cè)出來。有關(guān)研究報(bào)道[9-11]，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)16kD抗原在診斷結(jié)核病的敏感度為23.5%～68.1%，特異度為69.5%～89.1%，和 38kD抗原聯(lián)合檢測(cè)的敏感度達(dá)到49.02%～70.1%，特異度為70.3%～82.0%。Rv2041c抗原是一種分泌蛋白，分子量約為30 kD，在肺結(jié)核患者的肺部高表水平達(dá)。對(duì)滲出期肺結(jié)核患者的痰液進(jìn)行檢測(cè)，可以查及該蛋白升高，Rv2041c抗原可以刺激宿主發(fā)生強(qiáng)烈的抗原抗體反應(yīng)[12]。有關(guān)研究[13]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的毒力越高，抗Rv2041c的抗體滴度就越高。國(guó)內(nèi)學(xué)者[14]通過研究發(fā)現(xiàn)Rv2041c檢測(cè)結(jié)核病的敏感度為30.2%～50.1%。我們把這兩種蛋白融合成一個(gè)新的蛋白抗原，發(fā)現(xiàn)融合抗原具有較好的免疫原性，其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的敏感度和特異度分別為72.0%、83.8%，高于單個(gè)抗原檢測(cè)，也可以作為結(jié)核病血清學(xué)診斷的備選抗原。

在100例肺結(jié)核病患者中，38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c檢測(cè)的敏感度分別為69.0%、72.0%，明顯高于痰培養(yǎng)(21.0%)、38kD試劑盒(20.0%)、16kD試劑盒(26.0%)，P<0.01；低于38kD+16kD(74.0%)試劑盒，但無明顯差異，P>0.05。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原檢測(cè)抗結(jié)核抗體的特異度分別為85.4%、83.8%，顯著高于38kD試劑盒(61.1%)、16kD(50.0%)；低于38kD+16kD(88.9%)，但無顯著差異，P>0.05。

對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行分析，我們可以知道結(jié)核分枝桿菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在診斷結(jié)核方面的價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢查，并且明顯較目前臨床上應(yīng)用比較廣泛的38kD、16kD抗體試劑盒更具有優(yōu)勢(shì)。但仍然達(dá)不到WHO所提出的要求。

我們以ROC曲線中特異度為90%時(shí)的38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的化學(xué)發(fā)光值為診斷結(jié)核病的界限值，將這兩種結(jié)核分枝桿菌融合抗原聯(lián)合應(yīng)用檢測(cè)抗結(jié)核抗體，我們發(fā)現(xiàn)其敏感度(89.0%)得到了大幅度的提高，其特異度卻無明顯降低(82.3%)。我們進(jìn)一步分析其原因，可能是因?yàn)檫@兩種結(jié)核分枝桿菌融合抗原含有多種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原決定簇。

通過以上研究結(jié)果，我們可以看出結(jié)核分枝桿菌融合蛋白38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c都有非常高的免疫原性分別將其用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷上均具有較高的靈敏性及特異度，將這兩種結(jié)核分枝桿菌融合抗原聯(lián)合以后，能夠較好的提高結(jié)核病診斷的陽性率，對(duì)特異度沒有影響，這兩種結(jié)核分枝桿菌融合蛋白可以應(yīng)用到結(jié)核病的臨床診斷中去。

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*作者簡(jiǎn)介：郭洪娜(1978—)，女，本科，主管技師，從事臨床檢驗(yàn)工作。

中圖分類號(hào)：R446.11+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2016)07-0738-04

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.006

(收稿日期2016-03-07)

The application value of fusionantigen 38kd-rv1419, 16kd-rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of tuberculosis

GUO Hong-na

(Dept. of Clinical Laboratory, Yishui Central Hospital of LinYi City, Yishui 276400, China)

Abstract:Objective: To study the application value of fusion antigen 38kD-Rv1419, 16kD- Rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of TB. Methods: With sputum smear and sputum culture and standard kit as a control, the IgG level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group and non-TB respiratory disease group and health control group were detected by Chemiluminescence immunoassay, in order to study its value in serological diagnosis of TB. Results: ① Antibody level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group (143621.0±23231.7, 179731.1±16342.1) were obviously higher than that in non-TB group(27417.5±2371.8, 32066.2±3310.9) and health control group (35262.9±5764.2, 22765.5±3695.7), (P<0.05). ② The sensitivity of 38kD-Rv1419(69.0%), 16kD- Rv2041c(72.0%) was higher than that of using sputum culture (21.0%), 38kD kit (20.0%) and 16kD kit (26.0%), (P<0.05). ③ The specificity of 38kD- Rv1419 (85.4%), and 16kD-Rv2041c(83.8%)was higher than that of 38kD kit(61.1%) and 16kD kit(50.0%), (P<0.05). ④ The sensitivity of fusion antigen 38kD-Rv1419 combined with 16kD-Rv2041c was 89.0%, which was higher than that of 38kD-Rv1419 (69.0%), and 16kD-Rv2041c (72.0%), (P<0.05). Conclusion: The sensitivity and the specificity of the fusion antigen 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c are high in serological diagnosis in TB, and the sensitivity of 38kD-Rv1419 plus 16kD-Rv2041c is increased in TB dignosis.

Key words:38kD-Rv1491; 16kD-Rv2041c; chemiluminescent immunoassay; serological diagnosis