楊艷茹　劉景景　孫利利　趙　晶　王　浩　馬　健　王德才

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安　271016)

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替莫唑胺誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞系U251/TR的構(gòu)建及衣霉素對其耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用*

楊艷茹劉景景孫利利趙晶王浩馬健王德才

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安271016)

摘要：目的構(gòu)建替莫唑胺(temozolomide，TMZ)耐藥細(xì)胞系U251/TR，并觀察衣霉素(tunicsmycin,Tm)逆轉(zhuǎn)對替莫唑胺耐藥細(xì)胞系U251/TR 細(xì)胞的作用。方法采用替莫唑胺對U251細(xì)胞進(jìn)行體外分步誘導(dǎo)，產(chǎn)生耐藥的U251/TR 細(xì)胞系；CCK-8法檢測TMZ對U251和U251/ TR 細(xì)胞增殖抑制作用，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，得到U251/TR細(xì)胞系對TMZ的耐藥指數(shù)(RF)；采用細(xì)胞集落法確定U251/TR的耐藥性；將Tm聯(lián)合TMZ作用于U251/TR細(xì)胞系，采用CCK-8法分別測定不同給藥組細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果通過體外分步誘導(dǎo)法成功地建立了對TMZ具有穩(wěn)定耐藥性的U251/TR細(xì)胞株。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，U251/TR的耐藥指數(shù)約為5.2；細(xì)胞集落法確定誘導(dǎo)過程中的U251/TR的耐藥性為1.2～3倍。Tm和TMZ聯(lián)合應(yīng)用呈協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論成功建立了由TMZ誘導(dǎo)的人腦膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株U251/TR。Tm聯(lián)合TMZ能顯著逆轉(zhuǎn)U251/TR 細(xì)胞系的耐藥性。

關(guān)鍵詞：替莫唑胺；腦膠質(zhì)瘤；耐藥性；衣霉素

腦膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤[1]，目前多采取手術(shù)切除和術(shù)后輔以化療及放療的綜合治療方案，烷化劑替莫唑胺(temozolomide，TMZ)容易通過血腦屏障，是目前最有效的治療腦膠質(zhì)瘤的化療藥物[2]。但是膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ具有原發(fā)或繼發(fā)性耐藥作用，這嚴(yán)重制約了膠質(zhì)瘤的治療效果[3]。衣霉素(tunicamycin，Tm )是天然的抗生素，可通過抑制蛋白糖基化誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)Tm可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[5-6]。本研究擬建立TMZ耐藥細(xì)胞系U251/TR細(xì)胞模型，通過研究Tm聯(lián)合TMZ 逆轉(zhuǎn)U251/TR細(xì)胞耐藥的作用，嘗試在體外探討這兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用作為膠質(zhì)瘤化療方法的可行性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 替莫唑胺(TMZ，美國Sigma公司)，衣霉素(Tm，比利時百靈威公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)，CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國invitrogen公司)。

1.1.2 細(xì)胞人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1U251細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代把凍存的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251復(fù)蘇后，培養(yǎng)于10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%左右時以0.125%胰蛋白酶消化，按1∶3接種傳代，經(jīng)2～3次傳代后至指數(shù)生長期進(jìn)行實驗。

1.2.2細(xì)胞耐藥分步誘導(dǎo)將處于對數(shù)生長期的U251細(xì)胞傳代后，以6000/孔的密度接種在96孔板里，測定TMZ對U251細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，為93.7 μg/ml。以IC50的1/150 TMZ，即0.625μg/ml加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導(dǎo)劑量，依次為1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml、160 μg/ml，每個劑量保持培養(yǎng)14d左右。至第6個月末可誘導(dǎo)出對TMZ具有5倍耐藥的細(xì)胞系，并命名為U251/TR。

1.2.3 細(xì)胞集落法確定耐藥性取TMZ 80 μg/ml誘導(dǎo)劑量時的細(xì)胞進(jìn)行耐藥性檢測。將U251/IR細(xì)胞和U251細(xì)胞以200個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，24h后分別加入TMZ 20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml。兩種細(xì)胞均同時設(shè)無藥對照組以便計算給藥組細(xì)胞集落形成相對率。加藥后連續(xù)培養(yǎng)15d，棄培養(yǎng)液，以0.5%亞甲蘭乙醇染色計數(shù)細(xì)胞集落，比較兩組細(xì)胞間的細(xì)胞集落形成相對率。

1.2.4CCK-8法檢測U251/TR對TMZ的耐藥指數(shù)分別將對數(shù)生長的U251/TR細(xì)胞和U251細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每種藥物設(shè)3個復(fù)孔。過夜培養(yǎng)后加入TMZ，培養(yǎng)24h。棄上清，每孔加入10 μl的CCK-8培養(yǎng)1～2h后，經(jīng)TIKEN酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm波長下的OD值。抑制率=(對照組平均OD值-用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%，由直線回歸方程計算出不同藥物濃度兩組細(xì)胞各自的半抑制濃度(IC50)，按以下公式得出U251/I'R的耐藥指數(shù)(RI)，RI=IC50(U251/TR)/I C50(U251)。

1.2.5 CCK-8法檢測Tm聯(lián)合TMZ對U251/ TR細(xì)胞增殖抑制作用培養(yǎng)U251/ TR 細(xì)胞株，分為3組：Tm組、TMZ組、Tm聯(lián)合TMZ 組，以6000個/孔接種到96 孔板，待細(xì)胞貼壁后(18～24h)，加入藥物，其中Tm組加入不同濃度的Tm (1μM，5μM )，TMZ組加入不同濃度的TMZ (0.5mM，1mM，1.5mM ), Tm聯(lián)合TMZ組為分別加入不同濃度的Tm和TMZ。藥物作用24h后，CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況，具體方法同上。

1.2.6統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad prism 4.0 進(jìn)行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用方差分析。以P≤0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用金正均法計算Q值來評價藥物合用對細(xì)胞增殖是否有協(xié)同作用[7]，Q=E(a+b)/(Ea+Eb)-Ea×Eb，E(a+b)為合用抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥的抑制率。Q值>1.15為協(xié)同增效，0．85～1.15相加，<0．85為拮抗。

2結(jié)果

2.1TMZ 誘導(dǎo)的U251/ TR膠質(zhì)瘤細(xì)胞株耐藥性測定

2.1.1檢測U251/TR 細(xì)胞株的耐藥指數(shù)(RI)以TMZ的濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，腫瘤細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制率曲線，并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，U251細(xì)胞IC50值為93.75μg/ml(0.49 mM)，U251/ TR 細(xì)胞IC50值為487.6 μg/ml(2.5mM)，計算得出U251/TR 的耐藥指數(shù)(RI)約為U251的5.2倍(圖1，表1)。

圖1　不同濃度TMZ對U251和U251/TR細(xì)胞存活率的影響

DrugIC50(mM)U251U251/TRRIP值TMZ0.482.55.2<0.05

2.1.2細(xì)胞集落法確定U251/ TR 的耐藥性結(jié)果表明，不同濃度的TMZ處理的U251/ TR 細(xì)胞集落相對率均明顯高于親本U251細(xì)胞(P<0. 05)，U251/ TR 是U251細(xì)胞的1.2～3倍(圖2)，U251/ TR細(xì)胞具有相對明顯的耐藥性。

圖2　不同濃度TMZ處理的U251和U251/TR細(xì)胞相對集落形成率(*P<0.05,**P<0.01)

2.2Tm對于TMZ的耐藥逆轉(zhuǎn)Tm對U251/ TR 細(xì)胞IC50值為7.6 μM ，本實驗選擇(1μM，5μM ) Tm和(0.5mM ，1mM ，1.5mM )TMZ聯(lián)合給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物聯(lián)合給藥作用24h對U251/ TR細(xì)胞增殖抑制率大于兩藥單獨使用(表2，圖3)。金正均法計算的Q值均>1.15，表明兩藥合用產(chǎn)生的作用遠(yuǎn)大于兩藥單獨相加，產(chǎn)生協(xié)同效果(表3)。

表2　Tm和TMZ聯(lián)合給藥對U251/TR細(xì)胞存活率的影響

注：n=4，表內(nèi)值為細(xì)胞存活率(%)。

圖3　Tm和TMZ聯(lián)合給藥對U251/TR細(xì)胞存活率的影響(*P<0.05,**P<0.01)

Tm(μM)TMZ(mM)0.511.511.6951.5011.41451.5221.4461.426

3討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，由于其呈浸潤性生長和常累及腦的重要功能區(qū)，手術(shù)很難做到徹底清除，且復(fù)發(fā)率高，因此術(shù)后的化療是重要的治療措施，尤其隨著新型化療藥物的出現(xiàn)和新化療方案的探索，化療療效有了很大的提高[1]。臨床實踐證明烷化劑TMZ有良好的抗膠質(zhì)瘤活性，然而，耐藥性的產(chǎn)生限制了TMZ的化療效果，是造成膠質(zhì)瘤化療失敗的主要原因[2-3]，因此在體外建立對TMZ耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，對于探討逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤耐藥的有效策略，提高膠質(zhì)瘤的化療效果有重大臨床意義。Tm是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，通過抑制蛋白糖基化引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Tm對多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，比如，Tm通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而誘導(dǎo)U973組織淋巴瘤細(xì)胞凋亡[5]，通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901和BGC-823凋亡[6]。同時，有研究報道Tm可增強(qiáng)赫賽汀抗乳腺癌的活性[8]，還可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。但是Tm對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的直接生物學(xué)作用和對TMZ耐藥的影響尚不清楚。

臨床研究表明，腫瘤細(xì)胞的耐藥倍數(shù)一般約2倍左右，本實驗成功地誘導(dǎo)出了人腦膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株U251/TR，與親本細(xì)胞U251相比，U251/TR對TMZ的耐藥指數(shù)是5.2倍，比較接近臨床上的實際耐藥現(xiàn)象。在膠質(zhì)瘤耐藥模型U251/TR細(xì)胞上，聯(lián)合給予Tm和TMZ，觀察Tm對TMZ的耐藥逆轉(zhuǎn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMZ 1μM和5μM能明顯增強(qiáng)U251/TR細(xì)胞對TMZ的敏感性，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥的作用。Tm的抗腫瘤作用可能與其抑制增殖、誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡及其他程序性死亡途徑有關(guān)，但其逆轉(zhuǎn)U251/TR細(xì)胞耐藥的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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*基金項目：山東省自然科學(xué)基金(ZR2011HQ055)，國家自然科學(xué)基金(81302202，81441111)。

作者簡介：楊艷茹(1990—)，女，碩士研究生，研究方向：腫瘤藥理學(xué)。 通訊作者：王德才(1962—)，男，教授，E-mail: dcwang@tsmc.edu.cn。

中圖分類號：R965

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-7115(2016)07-0721-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.001

(收稿日期2016-03-08)

Establishment of drug-resistance U251/TR cell lineinduced by temozolomide and reverse effects of tunicamycin

YANG Yan-ru LIU Jing-jing SUN Li-li ZHAO Jing WANG Hao MA Jian WANG De-cai

(Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Abstract:Objective: To establish drug-resistance U251/TR cell line with timozolomide(TMZ), and to study the effect of tunicamycin(Tm) on reversing temozolomide resistance in glioma cells. Methods: Drug resistance of U251glioma cells was induced by the stepwise revulsion with TMZ. The proliferative inhibition effect of TMZ on U251,U251/ TR cell line and IC50value were evaluated by CCK-8 method.The drug resistance and resistance index (RI) were determined by cell colony experiment and CCK-8 assay. The combination of Tm(1μM,5μM) and TMZ (0.5mM,1.5mM,5mM) on U251/TR cells were tested by CCK-8 method. Results: U251/ TR cell line of drug resistance was successfully induced by TMZ with step wise revulsion method in 6-month culture. The cell cloning experiment demonstrated that the colony-foming efficency of U251/TR cells was 1.2～3times that of U251cells. The drug resistance index was about 5.2in U251/TR cell line assayed by CCK-8 method. Combined Tm and TMZ treatment showed a synergistic effect in U251/TR cell (Q>1.15). Conclusion: The drug resistant U251/TR cell line was established successfully. Combination of Tm with TMZ could reverse durg resistance of U251/TR cells.

Key words:timozolomide; glioma; drug-resistance; tunicamycin