田萬強,梅楚剛,付常振,辛亞平,張　松,王國慶,昝林森,3

(1 楊凌職業(yè)技術(shù)學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

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牛PRKAA2基因SNP檢測及與其生長和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

田萬強1,2,梅楚剛2,付常振2,辛亞平2,張松2,王國慶2,昝林森2,3

(1 楊凌職業(yè)技術(shù)學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛共630頭個體的單磷酸腺苷激活的蛋白激酶α2亞基(AMPKα2)基因PRKAA2的多態(tài)性，并分析其多態(tài)性與200頭秦川牛生長及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性?！痉椒ā?利用PCR-SSCP、DNA測序、飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)等技術(shù)，分析檢測4個品種牛PRKAA2基因6個外顯子的單核酸多態(tài)性(SNPs)；采用生物信息學方法結(jié)合統(tǒng)計分析軟件，分析秦川牛各多態(tài)位點的遺傳變異特性與體尺及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)果】 PRKAA2基因第2、4、6、7、8、9外顯子中，只檢測到第4外顯子27 G>C和60 T>C 2個突變位點；關(guān)聯(lián)分析表明，27 G>C位點與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)；60 T>C位點與秦川牛體斜長極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長、腰角寬、坐骨端寬、眼肌面積顯著相關(guān)(P<0.05)?！窘Y(jié)論】 PRKAA2基因?qū)η卮ㄅ２糠煮w尺及肉質(zhì)性狀有極顯著或顯著影響，可作為秦川肉牛新品種早期選擇的候選基因和分子輔助標記。

[關(guān)鍵詞]秦川牛；PRKAA2基因；單核酸多態(tài)性(SNPs)；體尺性狀；肉質(zhì)性狀

在動物生產(chǎn)中，家畜自開始馴化就受到集中選擇，特別是關(guān)于生長、發(fā)育、繁殖、行為和對疾病的抵抗力等性狀[1]。近年來，隨著分子育種技術(shù)的成熟，標記輔助選擇(Marker assisted selection, MAS)方法已成為育種工作者對家畜重要經(jīng)濟性狀進行標記選擇進而提高育種效率的有效途徑[2]。

哺乳動物單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一個異源三聚體蛋白質(zhì)，其組成亞基有α、β、γ 3種[3-6]。已知的AMPK亞型包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3共7種。從理論上來講，α、β、γ的不同異構(gòu)型可形成多達12種組合[5-8]。AMPKα2亞單位的編碼基因為PRKAA2，該基因主要在心臟、骨骼肌和肝臟中表達[9]，且大部分位于細胞核內(nèi)[10]。定位于核內(nèi)的PRKAA2可以通過部分磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來達到調(diào)節(jié)基因表達的作用[11-12]。

AMPKα2是參與AMPK激活的重要組成部分，是脂聯(lián)素抑制肝臟葡萄糖輸出的關(guān)鍵性靶點[13]，PRKAA2基因的缺陷或表達水平降低將直接影響AMPK的作用，從而導致高糖血癥及糖尿病的發(fā)生。Viollet等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2基因敲除小鼠(PRKAA2-/-)表現(xiàn)為明顯的高糖血癥和胰島素抵抗。Beall等[15]認為活化的AMPKα2亞基可能通過上調(diào)線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的濃度來維持胰島β細胞對葡萄糖的敏感性。Foretz等[16]和Viana等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠的肝臟中短期表達活化形式的AMPKα2可以引起輕微的低糖血癥，而在糖尿病小鼠模型中同樣的處理可使原有的高糖血癥有所緩解。

牛PRKAA2基因(GenBank登錄號：AC_000160)位于20號染色體，基因全長71 908 bp，包含8個內(nèi)含子和9個外顯子。目前，對該基因多態(tài)性的研究多集中在人上。Horikoshi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2多態(tài)性與日本人群胰島素抵抗和Ⅱ 型糖尿病有關(guān)。劉靖星[19]以甘肅蘭州人群為對象，研究了PRKAA2基因多態(tài)性與Ⅱ型糖尿病及脂聯(lián)素、抵抗素(Resistin)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)病例組和對照組中均存在AMPK-rs2796516位點G/A基因突變，Ⅱ型糖尿病患者AMPK-rs2796516 G/A基因多態(tài)性與胰島素抵抗和血脂代謝明顯相關(guān)(P<0.05)。宋嬌等[20]在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn)，PRKAA2基因表達水平與肌內(nèi)脂肪(IMF)沉積顯著相關(guān)(P<0.05)，1日齡AA雞PRKAA2基因表達水平顯著高于56日齡(P<0.05)，IMF含量1日齡顯著高于56日齡(P<0.05)，PRKAA2基因表達與IMF含量呈正相關(guān)。高麗南[21]研究發(fā)現(xiàn)，西雜牛、利雜牛、夏雜牛PRKAA2基因第4外顯子55 513 bp處均發(fā)生了C>T突變，在第6外顯子 59 233 bp處發(fā)生了A>G突變，但關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3種肉牛PRKAA2基因第4外顯子和第6外顯子突變位點不同基因型與肉牛個體脂肪含量、體質(zhì)量、屠宰率等性狀均無顯著差異(P>0.05)。

本試驗以秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛等4個牛品種作為研究對象，探究其PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并分析其多態(tài)性與秦川牛體尺和肉質(zhì)性狀是否相關(guān)，以期尋求該基因與秦川牛體尺和肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的遺傳標記位點，為肉牛新品種(系)的培育提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

蛋白酶K購自德國默克公司；Tris飽和酚、EDTA、Tris、硼酸、甲醛、丙烯酰胺(Acrylamide)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰氨(Bis)、二甲基亞砜(DMSO)、N,N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、含染料Reaction MIX、DNA Marker、瓊脂糖等，均購自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)和去離子甲酰氨，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，冷凍高速離心機(CENTURION，英國)，電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、脫色搖床(六一儀器，北京)，Aquila Vet CE0344型獸用B超儀(Pie公司，荷蘭)。

1.2牛血樣的采集及其體尺和肉質(zhì)性狀的測量

從4個牛品種群體中隨機抽取個體，每頭牛頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(血液)∶V(ACD)=6∶1)，輕微顛倒混勻，-80 ℃保存?zhèn)溆?。共采取血液樣?30份，其中秦川牛364份，血樣采自陜西秦川牛業(yè)有限公司楊凌秦川肉牛良種繁育中心；南陽牛84份，血樣采自河南省南陽市南陽黃牛繁殖場；魯西牛102份，血樣采自山東魯西牛保種場；安格斯牛80份，血樣采自陜西秦寶牧業(yè)發(fā)展有限公司眉縣繁育場。從秦川牛中選取飼養(yǎng)條件相同的24～30月齡健康育肥閹牛200頭，測量其8項體尺指標(體斜長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬)，并采用B超儀測定3項肉質(zhì)指標(背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪)。

1.3血液DNA的提取及檢測

采用酚-氯仿法[22]從血樣中提取牛基因組DNA，用質(zhì)量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。DNA無降解的用紫外分光光度計測定其質(zhì)量濃度，稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4牛PRKAA2基因外顯子的多態(tài)性檢測

1.4.1引物的設(shè)計與合成通過查閱NCBI上提供的牛PRKAA2基因序列(GenBank登錄號：AC_000160)，利用Primer 5.0軟件分別針對外顯子2、4、6、7、8、9設(shè)計P1、P2、P3、P4、P5、P6共6對特異性引物(見表1)，交由上海(生工)生物工程股份有限公司合成。

表 1　牛PRKAA2基因外顯子的引物設(shè)計Table 1　Primers of PRKAA2 gene in cattle

1.4.2PCR擴增反應由15 μL體系組成：其中dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL、TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.15 μL、10×Buffer(含15 mmol/L Mg2+)的MIX 6.85 μL、5 μmol/L混合引物(上游引物和下游引物均為10 pmol/μL) 各0.3 μL、模板DNA (50 ng/μL) 1.0 μL、ddH2O 5.9 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3PCR擴增產(chǎn)物的回收及純化使用DNA回收試劑盒進行PCR擴增產(chǎn)物回收純化，按照試劑盒具體說明進行操作，純化產(chǎn)物送交上海(生工)生物工程股份有限公司測序。

1.4.4PCR-SSCP分析取PCR產(chǎn)物5 μL與10 μL變性緩沖液( 按照去離子甲酰胺9.9 mL，5 mol/L EDTA 100 μL，二甲苯青0.012 5 g，溴酚藍0.012 5 g配制，調(diào)pH 為8.0)混合于PCR反應管，98 ℃變性10 min，迅速將管插入冰水混合物中冰浴5～10 min，然后加樣于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中，先進行15 min 250 V高壓電泳，再115 V電泳16 h。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用超純水漂洗 2～3 次，然后加0.1%硝酸銀溶液浸沒凝膠，在脫色搖床上染色10～15 min；棄染色液，超純水漂洗2～3次，加少量20 g/L NaOH與甲醛混合顯色液(500 mL 20 g/L NaOH溶液和5 mL甲醛)預顯色30 s，棄顯色液，然后再加新鮮顯色液至凝膠浸沒，搖動直至顯現(xiàn)清晰條帶為止。

1.4.5飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)選取質(zhì)量和質(zhì)量濃度(20～50 ng/μL)均符合 MALDI-TOF飛行質(zhì)譜要求的DNA，與針對待測位點設(shè)計的引物(每個待測位點處設(shè)計3條特異性引物，其中2條用于 PCR擴增，1條用于延伸)一起，送上海(生工)生物工程股份有限公司進行MALDI-TOF分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用遺傳多樣性分析軟件(Genpop 32)統(tǒng)計各突變位點的等位基因頻率和基因型頻率，同時計算多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和遺傳純合度(Ho)[23-24]。其中，PIC>0.5說明該突變位點處于高度多態(tài)；0.25

2結(jié)果與分析

2.1PRKAA2基因外顯子2、6、7、8多態(tài)位點的檢測

2.1.1PRKAA2基因外顯子2、6、7、8 PCR擴增結(jié)果對4品種牛PRKAA2基因的外顯子 2、6、7、8進行PCR擴增，所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段長度與預期擴增產(chǎn)物片段長度一致，條帶清晰特異性好(以秦川牛為例的結(jié)果見圖1)，可直接進行SSCP 檢測。

圖 1　秦川牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8的PCR擴增結(jié)果 A.外顯子2;B.外顯子6;C.外顯子7;D.外顯子8；M.DNA Marker DL 2000；1～5.PCR擴增產(chǎn)物Fig.1　Amplified products of PRKAA2 exon 2,exon 6,exon 7 and exon 8 in Qinchuan cattle A.Exon 2;B.Exon 6;C.Exon 7;D.Exon 8；M.DNA Marker DL 2000；1-5.Products of PCR

2.1.2PRKAA2基因外顯子2、6、7、8 的PCR-SSCP分析4品種牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8的 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測，結(jié)果(以秦川牛為例的結(jié)果見圖2)在各牛群中均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)。

圖 2　秦川牛PRKAA2基因外顯子 2、6、7、8 的PCR-SSCP檢測結(jié)果 A.外顯子2;B.外顯子6;C.外顯子7;D.外顯子8Fig.2　PCR-SSCP detection of PRKAA2 exon 2,exon 6,exon 7 and exon 8 in Qinchuan cattle A.Exon 2;B.Exon 6;C.Exon 7;D.Exon 8

2.2PRKAA2基因外顯子4、9的多態(tài)位點檢測

2.2.1PRKAA2基因外顯子4、9 的PCR擴增及突變位點檢測秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛4個群體中每個群體隨機挑選10頭個體的DNA樣品，分別對其PRKAA2基因的外顯子4、9進行PCR擴增，所得產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增片段長度與預期擴增產(chǎn)物片段長度一致，條帶清晰、特異性好(以秦川牛為例的結(jié)果見圖3)。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后，送上海(生工)生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果用DNA STAR比對，在PRKAA2基因外顯子 4上發(fā)現(xiàn)了2個潛在的多態(tài)位點，分別是第27位顛換G>C和第60位轉(zhuǎn)換T>C。將這2個多態(tài)位點分別命名為27 G>C、60 T>C。而在第9外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變位點。經(jīng)分析，外顯子 4上的27 G>C、60 T>C突變均未引起氨基酸的變化，屬同義突變。27 G>C位點測序得到GG、GC 2種基因型(以秦川牛為例的結(jié)果見圖4)，60 T>C位點測序得到TT、TC 2種基因型(以秦川牛為例的結(jié)果見圖5)。

圖 3　秦川牛PRKAA2 外顯子4、9 PCR擴增結(jié)果 A.外顯子4;B.外顯子9；M.DNA Marker DL 2000；1～6.PCR擴增產(chǎn)物Fig.3　Amplified products of PRKAA2 exon 4 and exon 9 in Qinchuan cattle A.Exon 4;B.Exon 9；M.DNA Marker DL 2000；1-6.Products of PCR

圖 4　秦川牛PRKAA2基因外顯子4第27位點GG、GC基因型測序圖(部分結(jié)果)Fig.4　Sequencing results of genotype GG and GC in PRKAA2-exon 4 at the 27th locus in Qinchuan cattle(Partial result)

圖 5　秦川牛PRKAA2基因外顯子4第60位點TT、TC基因型測序圖(部分結(jié)果)Fig.5　Sequencing results of genotype TT and TC in PRKAA2-exon 4 at the 60th site in Qinchuan cattle(Partial result)

2.2.2PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點飛行質(zhì)譜分型檢測及驗證因PRKAA2基因第4外顯子2個潛在突變位點距離太近，依靠PCR-SSCP等常規(guī)電泳試驗技術(shù)難以分型，故采用飛行質(zhì)譜技術(shù)對這2個位點進行進一步的基因分型檢測。

(1)PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點飛行質(zhì)譜檢測引物設(shè)計。對第4外顯子27 G>C和60 T>C突變位點分別設(shè)計特異性引物(見表2)。

(2)質(zhì)譜分型驗證及檢測結(jié)果。飛行質(zhì)譜結(jié)果除檢測到27 G>C和60 T>C突變位點通過測序確定的2種基因型外，還檢測到2個位點測序沒有發(fā)現(xiàn)的第3種基因型，即CC基因型，因此，飛行質(zhì)譜法得到27 G>C和60 T>C 2個位點全部基因型(圖6)。

表 2　牛PRKAA2基因外顯子4多態(tài)位點飛行質(zhì)譜引物設(shè)計Table 2　MALDI-TOF primer sequences of PRKAA2 gene exon 4 in cattle

圖 6　秦川牛PRKAA2基因第4外顯子多態(tài)位點飛行質(zhì)譜圖 A2-1為27 G>C位點；A2-2為60 T>C位點Fig.6　MALDI-TOF maps of SNPs of Qinchuan cattle PRKAA2 gene exon 4 A2-1 is 27 G>C locus and A2-2 is 60 T>C locus

2.3PRKAA2基因外顯子4 SNP位點遺傳多態(tài)性分析

2.3.1等位基因頻率、基因型頻率及H-W檢驗PRKAA2基因第4外顯子 2個SNPs 的基因型頻率和等位基因頻率統(tǒng)計結(jié)果見表3和表4。從表3和表4可以看出，2個SNPs 在4個牛群體中均以普通純合基因型頻率最高，其次為雜合基因型，突變型最低，說明這2個位點普通純合型為優(yōu)勢基因型。

表 3　PRKAA2基因第4外顯子 27 G>C SNPs位點基因型及等位基因頻率Table 3　Genotypic and allelic frequencies for 27 G>C locus in exon 4 of PRKAA2 gene

注：括號中的數(shù)據(jù)為觀測個體數(shù)。表4同。

Note：Data in brackets are the number of observations.The same for Table 4.

表 4　PRKAA2基因第4外顯子60 T>C SNPs位點基因型及等位基因頻率Table 4　Genotypic and allelic frequencies for 60 T>C locus in exon 4 of PRKAA2 gene

2.3.22個SNPs 位點在群體中的遺傳特性分析PRKAA2基因外顯子4中2個SNPs 在群體中的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、PIC分析統(tǒng)計結(jié)果見表5。由表5可以看出，試驗牛群在2個位點的群體基因雜合度在0.304 7～0.397 7，有效等位基因數(shù)在1.438 2～1.660 2，PIC為0.258 3～0.318 6，均介于0.25～0.50，表明4個牛群體在這2個位點均處于中度多態(tài)。經(jīng)χ2檢驗，秦川牛、南陽牛、魯西牛、安格斯牛在27 G>C和60 T>C 2個位點的χ2值均小于5.991，說明4個牛群體在這2個位點均處于H-W平衡狀態(tài)(P>0.05)。從總?cè)后w來看，4個牛群體在這2個位點均處于 H-W平衡狀態(tài)。

表 5　PRKAA2基因外顯子4中2個SNPs位點在各群體中的遺傳特性Table 5　Genetic indices of 2 SNPs for PRKAA2 gene exon 4 in every population

2.4秦川牛PRKAA2基因外顯子4多態(tài)性與體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析考慮場地、年齡和基因型的效應，利用 SPSS 軟件的 GLM 模型分析秦川牛PRKAA2基因多態(tài)性與其體尺性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果(表6)顯示，PRKAA2基因第4外顯子27 G>C多態(tài)位點與秦川牛8項體尺性狀指標未達到顯著相關(guān)(P>0.05)。60 T>C多態(tài)位點與秦川牛體斜長極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長、腰角寬、坐骨端寬顯著相關(guān)(P<0.05)。具體表現(xiàn)為體斜長性狀上，CC基因型個體極顯著高于TC和TT基因型個體(P<0.01)，TC、TT基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)；在尻長、腰角寬、坐骨端寬3項體尺性狀指標上，均是CC基因型個體顯著高于TC和TT基因型個體(P<0.05)，TC與TT基因型個體之間差異不顯著。

表 6　PRKAA2基因外顯子4中2個SNPs位點與秦川牛體尺性狀的關(guān)聯(lián)性Table 6　Association of 2 SNPs locus for exon 4 of PRKAA2 gene with growth traits in Qinchuan cattle 　cm

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Data with a different superscript capital letters in one column differ significantly at the level of 0.01,small letters at the level of 0.05.The following table is same.

2.4.2與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析利用 SPSS軟件的 GLM 模型分析秦川牛PRKAA2基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果(表7)顯示，PRKAA2基因外顯子4上27 G>C與背膘厚和眼肌面積2項指標顯著相關(guān)，GG、GC基因型顯著大于CC基因型(P<0.05)；60 T>C位點與秦川牛眼肌面積顯著相關(guān)，CC基因型顯著大于TC基因型(P<0.05)，CC與TT、TT與TC基因型之間差異不顯著(P>0.05)。

表 7　PRKAA2基因外顯子4中2個多態(tài)位點與秦川牛肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性Table 7　Association of 2 SNP locus for exon 4 of PRKAA2 gene with meat quality traits in Qinchuan cattle

3討論與結(jié)論

在真核生物中，AMPK是一個重要的蛋白激酶，是哺乳動物激酶級聯(lián)反應的核心組成部分，主要協(xié)調(diào)能量代謝的需要，通過阻斷三磷酸腺苷(ATP)消耗和促進ATP再生的生物合成途徑來防止哺乳動物細胞代謝應激，故有“細胞能量調(diào)節(jié)器”之稱[4-7,25]。

本研究在秦川牛、南陽牛、魯西牛和安格斯牛4個品種肉牛PRKAA2基因第2、6、7、8、9外顯子未檢測到突變位點，只在第4外顯子中均發(fā)現(xiàn)了27 G>C和60 T>C 2個突變，且均未引起相應氨基酸的變化，屬于同義突變。同義SNP是進化過程中對環(huán)境壓力的適應和自然選擇而形成的“密碼子使用偏好”在基因組中的遺跡，有研究表明它能通過影響翻譯效率[26]、mRNA的穩(wěn)定性[27]和拼接控制來調(diào)節(jié)機體生理活動[28]，或者由于密碼子替換導致翻譯速度發(fā)生改變，進而通過影響蛋白折疊的動力學控制使蛋白質(zhì)無法完成正確的折疊[29]。因此，同義突變從某種方面也能影響基因的表達和調(diào)節(jié)，進而影響個體表型性狀。

在4個牛群體中，27 G>C、60 T>C 2個突變位點均以普通純合基因型頻率最高，突變型頻率最低，2個位點的等位基因頻率表現(xiàn)同一趨勢，均是 G>C、T>C。對該基因的研究，單從檢測得到的SNP數(shù)量與Zhang 等[30]的研究結(jié)果比較，本研究只在第4外顯子檢測到2個SNPs，與Zhang等[30]在PRKAA2基因掃描的外顯子區(qū)域不同。

關(guān)聯(lián)分析顯示，27 G>C位點與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，60 T>C位點與秦川牛體斜長極顯著相關(guān)(P<0.01)，與體高、尻長、腰角寬、坐骨端寬、眼肌面積顯著相關(guān)。本研究的部分結(jié)果與Lin 等[31]在豬上得到的結(jié)果相一致，但與高麗南[21]在牛上報道的結(jié)果有較大差異，這可能與試驗牛品種差異有一定關(guān)系。

由本研究結(jié)果可知，PRKAA2基因可作為秦川牛標記輔助育種的候選基因，為秦川肉牛應用生物技術(shù)育種提供了新的思路和手段。然而因牛屠宰成本太高，本研究分析的數(shù)據(jù)和肉質(zhì)性狀相對偏少，還有待進一步擴大樣本數(shù)量對其他肉質(zhì)性狀進行分析，并在細胞水平更深層次研究該基因功能及其相關(guān)調(diào)控機理。

[參考文獻]

[1]Andersson L,Georges M.Domestic animal genomics:deciphering the genetics of complex traits [J].Nat Rev Genet,2004,5(3):202-212.

[2]Wu X L,MacNeil M D,De S,et al.Evaluation of candidate gene effects for beef backfat via Bayesian model selection [J].Genetica,2005,125(1):103-113.

[3]Hardie D G,Carling D.The AMP-activated protein kinase——fuel gauge of the mammalian cell [J].Eur J Biochem,1997,246:259-273.

[4]Hardie D G,Salt1 P,Hawley S A,et al.AMP-aetivated proteinkinase:an utrasensitive system for monitoring cellar energy change [J].Biochem J,1999, 338(3):717-722.

[5]Hardie D G,Carling D,Carlson M.The AMP-activated/SNF1 protein kinase subfamily:metabolic sensors of the eukaryotic cell [J].Annu Rev Biochem,1998,67:821-855.

[6]Hardie D G,Sakamoto K.AMPK:a key sensor of fuel and energy status in skeletal muscle [J].Physiology (Betllesda),2006,21:48-60.

[7]Wadley G D,Lee-Young R S,Canny B J,et al.Effect of exercise intensity and hypoxia on skeletal muscle AMPK signaling and substrate metabolism in humans [J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,290(4):E694-E702.

[8]Yu H,Fujii N,Hirshman M F,et al.Cloning and characterization of mouse 5′-AMP-activated protein kinase γ3 subunit [J].Am J Physiol Cell Physiol,2004,286:C283-C292

[9]Stapleton D,Mitehelhill K I,Gao G,et al.Mammalian AMP-activated protein kinase subfamily [J].J Biol Chem,1996,271:611-614.

[10]Turnley A M,Stapleton D,Mann R J,et al.Cellular distribution and development expression of AMP-activated protein kinase isoform in mouse central nervous system [J].J Neurochem,1999,72:1707-1716.

[11]Dyck J R,Gao G,Widmer J,et al.Regulation of 5′-AMP-activated protein kinase activity by the noneatalytie beta and gamma subunits [J].J Biol Chem, 1996, 271: 17798-17803.

[12]Dyck J R,Kudo N,Barr A J,et al.Phosphorylation control of cardiac acetyl-CoA carboxylase by cAMP-dependent protein kinase and 5′-AMP activated protein kinase [J].Eur J Biochem,1999,262(1):184-190.

[13]Andreelli F,Foretz M,Knauf C,et al.Liver adenosine monophosphate-activated kinase-alpha2 catalytic subunit is a key target for the control of hepatic glucose production by adiponectin and leptin but not insulin [J].Endocrinology,2006,147:2432-2441.

[14]Viollet B,Andreelli F,Jorgensen S B,et al.The AMP-activated protein kinase alpha2 catalytic subunit controls whole-body insulin sensitivity [J].Clin Invest,2003,111(1):91-98.

[15]Beall C,Piipari K,Al-Qassab H,et al.Loss of AMP-activated protein kinase alpha2 subunit in mouse beta-cells impairs glucose-stimulated insulin secretion and inhibits their sensitivity to hypoglycaemia [J].Biochem J,2010,429(2):323-333.

[16]Foretz M,Ancellin N,Andreelli F,et al.Short-term overexpression of a constitutively active form of AMP-activated protein kinase in the liver leads to mild hypoglycemia and fatty liver [J].Diabetes,2005,54(5):1331-1339.

[17]Viana A Y,Sakoda H,Anai M,et al.Role of hepatic AMPK activation in glucose metabolism and dexamethasone-induced regulation of AMPK expression [J].Diabetes Res Clin Pract,2006,73(2):135-142.

[18]Horikoshi M,Hara K,Ohashi J,et al.A polymorphism in the AMPKα2 subunit gene is associated with insulin resistance and type 2 diabetes in the Japanese population [J].Diabetes,2006,55(4):919-923.

[19]劉靖星.AMPKα2基因多態(tài)性與2型糖尿病及脂聯(lián)素、抵抗素相關(guān)性研究 [D].蘭州：蘭州大學,2009.

Liu J X.Correlation between AMPKα2 subunit gene polymorphism and type2 diabetes mellitus,adiponectin and resistin [D].Lanzhou:Lanzhou University,2009.

[20]宋嬌,付睿琦,李穎穎,等.肉雞PRKAA基因表達與MyHC基因表達和肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)系的研究 [J].中國畜牧雜志,2012,48(23):10-13.

Song J,Fu R Q,Li Y Y,et al.The study of relationship betweenMyHCgene expression and intramuscular fat deposition in broilerPRKAAgene expression [J].Chinese Journal of Animal Science,2012,48(23):10-13.

[21]高麗南.AMPK對肉牛脂肪沉積的影響及其基因多態(tài)性研究 [D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2012.

Gao L N.Research on AMPK and its gene polymorphism influence on beef fat deposition [D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University,2012.

[22]J薩姆布魯克,D W拉塞爾.分子克隆實驗指南(上、下冊) [M].黃培堂譯.北京:科學出版社,2002.

Sambrook J,Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual (Volume 1,2) [M].Translated by Huang P T.BeiJing:Science Press,2002.

[23]Nei M,Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases [J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1979,76(10):5269-5273.

[24]Nei M,Roychoudhury A K.Sampling variances of heterozygosity and genetic distance [J].Genetics,1974,76(2):379-390.

[25]Carling D.AMPK [J].Curr Biol,2004,14(6):R220.

[26]Lavner Y,Kotlar D.Codon bias as a factor in regulating expression via translation rate in the human genome [J].Gene,2005,345(1):127-138.

[27]Chamary J V,Hurst L D.Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals [J].Genome Biology,2005,6(9):R75.1-R75.12.

[28]Eskesen S T,Eskesen F N,Ruvinsky A.Natural selection affects frequencies of AG and GT dinucleotides at the 5′and 3′ends of exons [J].Genetics,2004,167(1):543-550.

[29]Purvis I J,Bettany A J E,Santiago T C,et al.The efficiency of folding of some proteins is increased by controlled rates of translationinvivo:a hypothesis [J].Journal of Molecular Biology,1987,193(2):413-417.

[30]Zhang Q,Zhao S,Chen H,et al.SNP discovery and haplotype analysis in the bovinePRKAA2 gene [J].Mol Biol Rep,2011,38:1551-1556.

[31]Lin L,Flisikowski K,Schwarzenbacher H,et al.Characterization of the porcine AMPK alpha 2 catalytic subunitgene (PRKAA2):genomic structure,polymorphism detection and association study [J].Anim Genet,2010,41:203-207.

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-06-0816:2010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.001

[收稿日期]2014-12-05

[基金項目]國家863計劃項目(2013AA102505)；國家自然科學基金項目(31272411)；陜西省自然科學基金項目(2007C127)；陜西省科學技術(shù)發(fā)展計劃項目(2011K01-09)

[作者簡介]田萬強(1969-),男,陜西扶風人,副教授，博士，主要從事家畜遺傳育種與繁殖研究。E-mail:twqiang2003@163.com [通信作者]昝林森(1963-)，男，陜西扶風人，教授，博士，博士生導師，主要從事動物遺傳育種及生殖生理調(diào)控研究。 E-mail:zanlinsen@163.com

[中圖分類號]S823.9+2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0001-09

SNPs of bovinePRKAA2 gene and its association with growth and meat quality traits

TIAN Wanqiang1,2,MEI Chugang2,FU Changzhen2,XIN Yaping2,ZHANG Song2,WANG Guoqing2,ZAN Linsen2,3

(1AnimalEngineeringDepartment,YanglingVocational&TechnicalCollege,Yangling,Shaanxi712100,China;2CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;3NationalBeefCattleImprovementCenter,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 Polymorphism of PRKAA2 gene on 630 individuals from four cattle breeds (Qinchuan,Nanyang,Luxi and Angus) was detected to analyze its genetic structures and varieties.The association of different genotypes with growth and meat quality traits of 200 Qinchuan cattle was also analyzed. 【Method】 SNPs located in exon 2,exon 4,exon6,exon 7,exon 8 and exon 9 were detected in PRKAA2 gene of four cattle breeds by PCR-SSCP,random DNA sequencing method and MALDI-TOF technology.Genetic variation of SNPs and the association of different genotypes with growth and meat quality traits of Qinchuan cattle were also analyzed by bioinformatics method and SPSS software.【Result】 Two SNPs (27 G>C and 60 T>C) located in only exon 4 were detected in 6 exons of PRKAA2 gene.The 27 G>C SNP was associated with back fat thickness (BF) and loin muscle area (LMA) (P<0.05) significantly.The 60 T>C SNP was associated with body length (BL) (P<0.01) extremely significantly,and with withers height (WH),rump length (RL),hip width (HW),pin bone width (PBW) and LMA (P<0.05) significantly.【Conclusion】 PRKAA2 gene had potential effects on growth and meat quality traits of Qinchuan cattle and could be used for candidate gene and marker-assisted selection (MAS) in early selection of new varieties of Qinchuan cattle.

Key words：Qinchuan cattle;PRKAA2 gene,SNPs;growth traits;meat quality traits

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