宋　銳　劉宗文(通訊作者)　劉怡伶　袁金金　張　恒　肖陳虎

鄭州大學第二附屬醫(yī)院　鄭州　450014

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microRNA141在膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義

宋銳劉宗文(通訊作者)劉怡伶袁金金張恒肖陳虎

鄭州大學第二附屬醫(yī)院鄭州450014

【摘要】目的探討microRNA-141(miR-141)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞中的表達情況及其與膠質(zhì)瘤臨床參數(shù)的關(guān)系。方法Real-time PCR方法檢測60例膠質(zhì)瘤，15例正常腦組織中miR-141的表達，檢測膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251及人腦正常星型膠質(zhì)細胞HEB中miR-141的表達，利用統(tǒng)計學工具分析膠質(zhì)瘤組織中的表達情況與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果與正常星型膠質(zhì)細胞對比，膠質(zhì)瘤組織中的miR-141表達升高明顯(P<0.05)，膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251中miR-141表達水平與正常星型膠質(zhì)細胞HEB中表達水平對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。膠質(zhì)瘤組織中mir-141的表達高低與患者腫瘤的大小、WHO分級及Ki67指數(shù)密切相關(guān)。結(jié)論miR-141在膠質(zhì)瘤癌組織及細胞系中高表達，與腫瘤大小、分化程度及是否轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-141能夠作為膠質(zhì)瘤今后醫(yī)療診斷的新指標及治療的新靶點。

【關(guān)鍵詞】miR-141；膠質(zhì)瘤；轉(zhuǎn)移

膠質(zhì)瘤是原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最為常見的惡性腫瘤，具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率和高致死率的特點。膠質(zhì)瘤約占所有原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的28%和顱內(nèi)惡性腫瘤的80%，在美國每年平均有超過50 000例新發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者[1]。在中國，在低于19歲的人群中，膠質(zhì)瘤發(fā)生率約占所有類型的55.56% ，高于顱內(nèi)其他類型腫瘤。對于20～59歲的人群中，31.10%顱內(nèi)腫瘤為膠質(zhì)瘤[2]。如今外科手術(shù)后行替莫唑胺聯(lián)合精準放療已成為目前高級別膠質(zhì)瘤的一線治療方案，然而膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存期仍低于15個月[3]。

miRNA是一類長度18～25個核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄以后水平調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達。miRNA通過與靶mRNA的3'-UTR 區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 降解或翻譯抑制，下調(diào)靶蛋白的表達，從而達到調(diào)控靶基因表達的目的[4]。它們可通過抑制腫瘤特定靶點基因的表達來作為癌基因或抑癌基因。大量研究表明miRNA可作為一種新型的標志物來評估腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和對治療的反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)mir-141在鼻咽癌組織中高表達并與其臨床分期相關(guān)[6]，但尚無其在膠質(zhì)瘤中的研究，因此該研究探討了膠質(zhì)瘤組織、膠質(zhì)瘤細胞系中miR-141的表達情況及miR-141與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

1材料與方法

1．1實驗材料

1．1．1標本：收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤標本60例及正常腦組織15例(腦外傷行部分腦組織切除術(shù)的病人)，60例膠質(zhì)瘤組織均經(jīng)過臨床病理學證實。標本采集后，迅速放入冰盒中凍存，然后于-80 ℃冰箱中儲存以備提取組織總RNA。

1．1．2細胞：膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251及人腦正常星型膠質(zhì)細胞HEB均購于上海細胞庫。

1．1．3主要試劑：DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液購自美國 HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；RNAiso plus、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTM II購自日本TAKARA公司；RT-PCR引物由上海生工合成。

1．2細胞培養(yǎng)U87、U251及HEB均為貼壁細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．3Real-time PCR利用TRIzol法提取Het-1a及膠質(zhì)瘤細胞和膠質(zhì)瘤組織中總RNA，檢測RNA的純度及濃度。結(jié)果顯示OD260/280比值均在1.80～2.0，符合要求。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按SYBR Green試劑說明書于實時熒光定量PCR儀進行擴增。

1．4統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析。均值檢驗采用student’s t test，相關(guān)行檢驗采用卡方檢驗，采用GraphPad Prism繪制統(tǒng)計圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2．1mir-141在膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細胞系中均為高表達膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織中mir-141的表達量分別為2.003±0.279 9 vs 0.693 2±0.284 4，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.276，P=0.0258<0.05)，見圖1。檢測人腦正常星型膠質(zhì)細胞HEB及不同膠質(zhì)瘤細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)U87和U251中mir-141的表達量分別為HEB的2.21倍和1.71倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1　miR141在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達　　圖2　miR141在HEB細胞及不同膠質(zhì)瘤細胞系中的表達

2．2miR-141表達與腫瘤患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析60例膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中miR-141表達水平與腫瘤病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，其表達與腫瘤大小、WHO分級及Ki67指數(shù)密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)，而與性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1　膠質(zhì)瘤患者miR-141表達量與臨床病理

3討論

近年來腫瘤與miRNAs相關(guān)性的研究受到越來越多的重視，諸多研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在多種腫瘤的致癌和抑癌過程中發(fā)揮重要作用。大量證據(jù)表明miRNAs調(diào)控著許多細胞過程，包括細胞分化、增殖、凋亡、壓力耐受、代謝以及細胞干性的維持[7]。1個miRNA可能有多個靶點，1個基因也可能受多種miRNAs的調(diào)控。因此，miRNAs和它的相關(guān)靶點構(gòu)成了1個能夠調(diào)控細胞生長過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。如miRNAs的下調(diào)癌基因的表達，這些基因稱為抑癌miRNAs；相反，如果miRNAs下調(diào)癌抑制性基因的表達，這些就稱為促癌miRNAs。Silber等[7]報道了miR-124 和miR-137在高級別膠質(zhì)瘤中低表達，并且在膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染miR-124 和miR-137后，更多的腫瘤細胞被阻滯在了G0/G1期，表明miRNA具有抑制腫瘤的潛能。我們的研究證明，與正常腦組織組織相比，mir-141在膠質(zhì)瘤組織中高表達，且食管癌細胞系與正常食管上皮細胞系相比，也顯示出了相同的趨勢。在膠質(zhì)瘤中mir-141與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，其表達與腫瘤大小、WHO分級及Ki67指數(shù)密切相關(guān)，而與性別、年齡無相關(guān)性。這就證明了mir-141可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后方面發(fā)揮重要的作用，能夠為膠質(zhì)瘤的診斷提供新型的標志物。

Mir-141屬于mir-200家族，該家族在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。近期大量的研究表明mir-141在不同類型的腫瘤中的表現(xiàn)存在差異，Zhou等[8]研究發(fā)現(xiàn)，mir-141在胃癌細胞系及胃癌組織中低表達，因其能夠與lncRNA-H19特異性結(jié)合，來抑制胃癌細胞系的增殖和侵襲。Van等[9]證明了與順鉑化療敏感的細胞系相比，順鉑耐藥的細胞系中存在表達升高的mir-141，其能夠抑制胞漿蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein-1)的表達，從而誘導(dǎo)順鉑的耐藥。Liu等[6]發(fā)現(xiàn)，mir-141在鼻咽癌組織中顯著高表達，并與BRD7的表達呈負相關(guān)，表明其鼻咽癌病人的生存相關(guān)，外源性的mir-141能夠增強腫瘤細胞的增殖能力，抑制凋亡率。另有研究發(fā)現(xiàn)，mir-141在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中低表達，并與FUS表達負相關(guān)，在給予細胞系慢病毒感染，使mir-141表達增高后，腫瘤細胞的增殖、細胞周期及遷移受到抑制，并增加了其對順鉑化療的耐藥性，從而證明了mir-141在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[10]。

綜上所述，mir-141在膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細胞系中高表達，且與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理參數(shù)高度相關(guān)，mir-141可能作為膠質(zhì)瘤新型的診斷指標和潛在的治療靶點。本課題組下一步的工作是研究mir-141在膠質(zhì)瘤中的作用機制，為其在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用提供參考。

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(收稿 2015-06-12)

【中圖分類號】R739.41

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)15-0025-02