陳英 于雋 楊舟 李飛 陳果 向麗婷 向娟 彭亮

摘要：目的 觀察艾灸對大鼠胃黏膜組織白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）及熱休克蛋白70（HSP70）表達的影響，探討艾灸對胃黏膜的保護效應與脊髓的關系。方法 實驗大鼠采用無水乙醇+阿司匹林灌胃制作胃黏膜損傷模型。將48只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組，每組12只。艾灸+脊髓橫斷組大鼠行脊髓橫斷手術，并予以艾灸干預。GUTH法計算胃黏膜組織損傷指數（UI），ELISA檢測血清IL-1β、TNF-α和EGF含量；Western blot檢測胃黏膜組織HSP70蛋白表達。結果 與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織UI下降、EGF含量升高，血清IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.05，P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織UI升高、EGF含量降低，血清IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達均明顯增加（P<0.01）。結論 脊髓是艾灸對胃黏膜損傷修復與保護因子表達的重要調節(jié)途徑。

關鍵詞：脊髓橫斷術；艾灸；胃黏膜損傷；保護因子；熱休克蛋白70；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.021

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0080-03

艾灸是一種溫熱刺激原，具有保護機體胃黏膜的功效。前期研究表明，艾灸對于引起胃黏膜損傷的多種復雜因素有調節(jié)性[1-2]。本研究在脊髓橫斷的前提條件下，觀察艾灸對大鼠胃黏膜組織白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）及熱休克蛋白70（HSP70）表達的影響，探討艾灸對胃黏膜的保護效應與脊髓的關系。

1 實驗材料

1.1 動物

48只健康成年SD大鼠，鼠齡3～4月，體質量180～200 g，雌雄各半，許可證號SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物中心實驗室，溫度23～26 ℃，濕度40%～60%，自由飲食飲水。

1.2 艾條和藥物

溫灸純艾條，蘄春時珍本草科技有限公司，規(guī)格φ4 mm×100 mm。青霉素，華北制藥股份有限公司，批號20141001；阿司匹林泡騰片，阿斯利康制藥有限公司，批號20141202。

1.3 主要試劑與儀器

10%甲醛（國藥集團化學試劑有限公司），ELISA檢測試劑盒、HSP70免疫組化檢測試劑盒（長沙維爾公司）。自制艾灸支架，隔熱薄膜。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及干預

實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組，每組12只，雌雄分籠飼養(yǎng)7 d。采用無水乙醇和阿司匹林灌胃制作胃黏膜損傷模型，艾灸+脊髓橫斷組大鼠予以脊髓橫斷手術，其他組正常飼養(yǎng)。術后大鼠用繩子俯臥位捆綁在鼠板上，參照文獻[3]腧穴定位“足三里”，剪毛，后貼上有孔隔熱貼，再把艾條固定在專門制作的艾灸支架上，將點燃的艾條施灸大鼠雙側“足三里”，距離穴位約0.5 cm。每日2次（8：00，14：00），連續(xù)8 d。正常組和模型組大鼠予8 d假艾灸捆綁操作。

2.2 胃黏膜組織損傷指數測定

大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉，將幽門及賁門部結扎處理，摘取全胃，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗，GUTH法計算大鼠胃黏膜損傷指數（UI）。損傷≤1 mm（包括斑點糜爛）計1分；1 mm<損傷≤2 mm計2分；2 mm<損傷≤3 mm計3分；3 mm<損傷≤4 mm計4分；損傷≥4 mm計5分；損傷寬度>2 mm者計分加倍。

2.3 胃黏膜組織相關因子測定

ELISA檢測大鼠血清IL-1β、TNF-α和胃黏膜組織EGF含量，嚴格按照試劑盒說明進行操作；Western blot檢測大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達，應用Imag J對WB條帶進行灰度分析，以β-actin作為內參對照，將目的蛋白灰度值除以β-actin灰度值校正誤差，以相對灰度值表示。

3 統計學方法

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示。符合正態(tài)分布采用方差分析，方差齊用SNK法或LSD法，方差不齊用Dunnett's T3法或Tamhan's T2法；不符合正態(tài)分布的用K Independent Samples法比較多個獨立樣本。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織損傷指數的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織UI明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織UI明顯降低（P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織UI明顯升高（P<0.01）。結果見表1。

4.2 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織表皮生長因子和血清白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織EGF和血清IL-1β、TNF-α含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織EGF含量明顯升高（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量明顯降低（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.3 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織熱休克蛋白70蛋白表達的影響

與模型組比較，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達明顯增加（P<0.01），艾灸+脊髓橫斷組HSP70蛋白表達較艾灸模型組降低（P<0.05）。結果見表3、圖1。

5 討論

艾灸具有行氣止痛、通經活絡、溫經散寒等功效。足三里是臟腑中胃的下合穴，又是經絡中足陽明胃經的合穴，故在針灸治療胃腸道疾病方面，足三里常常被用作首要穴位。有研究顯示，電針家兔足陽明胃經上的穴位進行治療發(fā)現，該經脈上的穴位均會對家兔胃黏膜產生不同的保護效應，而在這些穴位中，“足三里”對胃黏膜的保護效應最佳[4]。在機體胃黏膜受到損傷及修復過程中，機體進行自我保護機制最重要的是內源性保護機制，該機制的本質是機體適應性反應引發(fā)機體內源性保護物質的出現，多種生長因子和細胞因子參與了胃黏膜上皮損傷修復的調節(jié)。

EGF是一種內源性因子，能抑制胃酸、胃蛋白酶分泌，防止?jié)兊男纬?，具有促胃黏膜上皮細胞遷移和增殖的作用[5-6]，故EGF在修復機體受損傷的胃黏膜方面發(fā)揮著至關重要的作用。在本實驗中，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量較模型組均有不同程度的上升，而艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量較艾灸模型組降低，表明艾灸上調胃黏膜組織EGF含量的作用受到脊髓橫斷術的影響。

IL-1β具有促進機體的炎性細胞因子表達，并能促進機體中性粒細胞浸潤的作用。TNF-α也是一種炎性介質，可引起機體產生炎癥反應。本實驗結果表明，艾灸作用于胃黏膜受到損傷的大鼠能降低大鼠血清炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的含量，通過減輕炎癥反應達到保護大鼠胃黏膜的作用。而大鼠脊髓遭到橫斷后，艾灸作用于大鼠反而會上升大鼠血清IL-1β和TNF-α的含量。表明艾灸大鼠“足三里”通過細胞因子來保護胃黏膜的這一作用有脊髓的參與。

HSP70是胃黏膜保護中一類重要蛋白，具有細胞蛋白自穩(wěn)、協同免疫、抗細胞凋亡、抗氧化等作用。研究發(fā)現，艾灸能夠保護應激性胃黏膜受損傷大鼠的胃黏膜，這一保護過程可能與艾灸誘導大鼠胃黏膜組織HSP70表達有關[7]。HSP70在長時間乙醇和阿司匹林刺激胃黏膜后以及高熱后的表達明顯增加，能夠產生機體適應性的細胞保護作用[8-9]。

本實驗將大鼠脊髓橫斷觀察艾灸大鼠“足三里”對胃黏膜受損大鼠的抑制作用及對大鼠胃黏膜修復的保護作用。結果表明，艾灸大鼠“足三里”對大鼠胃黏膜損傷具有明顯的保護作用，而脊髓橫斷術對其保護作用產生干擾。表明脊髓是艾灸對大鼠胃黏膜相關因子及HSP70表達進行調節(jié)的重要途徑，脊髓是艾灸“足三里”對胃黏膜保護效應信號通路的一部分，起到重要的信號匯聚與整合的作用。

參考文獻：

[1] 杜燕，易受鄉(xiāng)，林亞平，等.艾灸對急性胃黏膜損傷大鼠熱休克蛋白與相關炎性細胞因子的影響[J].上海針灸雜志，2010，29（5）：269-272.

[2] 易受鄉(xiāng)，彭艷，常小榮，等.艾灸對應激性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡的影響及其與熱休克蛋白表達關系的研究[J].針刺研究， 2006，31（5）：259-271.

[3] 李忠仁.實驗針灸學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：255-257.

[4] 嚴潔，常小榮，鄧元江，等.電針足陽明經穴對家兔胃黏膜損傷細胞保護作用的研究[J].針刺研究，2001，26（4）：264-269.

[5] 姒健敏.關注生長因子對胃黏膜的保護作用[J].中華醫(yī)學雜志，2005， 85（39）：2744-2745.

[6] 賈赤宇，陳壁.EGF，TGF-β1，抗TGF-β1中和抗體對大鼠深Ⅱ°燙傷創(chuàng)面的影響[J].1999，20（5）：427-430.

[7] 李江山，嚴潔，何軍鋒，等.電針對心肌缺血模型大鼠孤束核c-fos表達及心電圖STⅡ的影響[J].針刺研究，2009，34（3）：171-173.

[8] ITOH Y H， ISHIGUCHI T， AYAKAWA Y. Expression of stress protein （HSP70） in adrenalectomized mice[J]. Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi，2002，62：161-167.

[9] ITOH Y H， NOGUCHI R. Pre-treatment with mild whole-body heating prevents gastric ulcer induced by restraint and water-immersion stress in rats[J]. Int J Hyperthermia，2000，16：183-191.