尹學來 宋豎旗 龐然 呂濟源 盧建新

摘要：目的 觀察化瘀降濁湯對轉化生長因子（TGF）-β1誘導HK-2細胞發(fā)生上皮間質轉分化（EMT）過程TGF-β/母系同源物家族Smad通路中關鍵因子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蝸形蛋白（Snail）的影響，探討其保護腎功能的作用機制。方法 MTT法測定不同濃度化瘀降濁湯對TGF-β1誘導HK-2的細胞增殖抑制率，計算半數(shù)抑制率（IC50）。Western blot和RT-PCR檢測E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和基因表達，間接免疫熒光檢測E-cadherin蛋白表達。結果 化瘀降濁湯在一定濃度范圍內抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞增殖，呈現(xiàn)出一定的量效關系，IC50為472.017 μg/mL。Western blot和RT-PCR檢測結果顯示，化瘀降濁湯中、高劑量組E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和mRNA表達與誘導組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；免疫熒光檢測結果顯示，化瘀降濁湯能促進E-cadherin蛋白表達，與Western blot分析結果一致。結論 化瘀降濁湯可能通過調節(jié)HK-2細胞TGF-β/Smad信號途徑中的關鍵蛋白達到抑制甚至逆轉腎小管EMT，從而對腎小管間質纖維化起到保護作用。

關鍵詞：HK-2細胞；上皮間質轉化；化瘀降濁湯；E-鈣黏蛋白；Smad3；蝸形蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0054-05

尿路梗阻性疾病引起的腎實質損害稱為梗阻性腎病，對于泌尿外科而言，引起梗阻性腎損害主要原因為上尿路結石，梗阻性腎病發(fā)展為終末期腎病的關鍵病理變化為腎間質纖維化。上皮間質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是啟動和維持腎間質纖維化的關鍵機制[1]。轉化生長因子-β（TGF-β）/母系同源物家族（Smads）信號通路是調節(jié)EMT和腎間質纖維化的關鍵信號通路。前期研究表明，益氣活血類中藥能明顯改善可復性單側輸尿管部分梗阻大鼠模型的的梗阻腎側及總腎的腎小球濾過率（GFR）水平[2]。本實驗觀察化瘀降濁湯對TGF-β1誘導HK-2細胞發(fā)生EMT過程中的TGF-β/Smads關鍵信號通路蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Smad3、蝸形蛋白（Snail）的影響，探討其保護腎功能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人近端腎小管上皮細胞株HK-2細胞，北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院柴立民教授惠贈。

1.2 藥物及制備

化瘀降濁湯（黃芪30 g，丹參30 g，桃仁30 g，莪術20 g，紅花10 g）飲片均購自康美藥業(yè)。將上述劑量的5倍中藥一半置于煎煮容器內，以10倍劑量的雙蒸水浸泡30 min，煮沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，將另一半中藥用10倍劑量乙醇煎煮，煎沸2 h，過濾藥渣倒出藥液，合并2次濾液。置于旋轉蒸發(fā)器內，旋轉蒸發(fā)制成膏劑、然后取出，置于真空干燥箱干燥48 h，將干燥的固體研磨成粉劑，用培養(yǎng)液分別配制成所需的濃度，然后濾器過濾，分裝至50 mL離心管中保存。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM/F12（Invitrogen），胎牛血清（Hyclone），Anti-E-cadherin抗體、Anti-Smad3抗體、Anti-Snail抗體（abcam），Goat Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（CST），High Capacity RNA-to-cDNA Kit、E-cadherin探針、GAPDH探針、Smad3探針、Snail探針（Life Tech），免疫染色一抗稀釋、免疫染色二抗稀釋液、免疫染色封閉液、DAPI（碧云天），Trioton-100（索萊寶），F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG（碧云天），TaqMan Gene Expression Master Mix（Life Tech），Trizol Reagent（Invitrogen），MTT（Sigma），重組人TGF-β1（pepro tech），胰酶（杭州吉諾）。6、96孔細胞培養(yǎng)板（美國corning），PHS-2F酸度計（上海雷磁儀器廠），MCO-18AIC細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO），DZF-6020真空干燥箱（上海-恒科技有限公司），RE52-05旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器），SIAFRT SYNERGYHT多功能酶標儀、nanodrop超微量分光光度計（美國Thermo Scientific），2020冰點滲透壓儀（美國ADVANCED），Bio-Rad電泳儀（美國Bio-Rad），Immobilon-P Transfer Membrane（美國Millipore），ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad），Applied Biosysterns 7500 Real-Time PCR Systems（美國ABI）。

2 實驗方法

2.1 藥液pH值和滲透壓測定

將MTT試驗中最大劑量1920 μg/mL藥液用酸度計及冰點滲透壓儀器測定3次，取其平均值，結果顯示pH值為7.385±0.015，滲透壓為289.673±2.057，兩者均在正常范圍內。

2.2 MTT法檢測HK-2細胞抑制率

參照文獻[3-4]，采用10 ng/mL TGF-β1誘導HK-2細胞24 h可發(fā)生EMT。因此，本實驗采用的藥物作用時間為24 h。取對數(shù)生長期HK-2細胞，胰酶消化液消化后用DMEM/F12培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調整濃度為1×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板，分為8組，均加200 μL含有10 ng/mL TGF-β1的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)24 h，分為8種不同濃度化瘀降濁湯培養(yǎng)基，使藥物終濃度為0、30、60、120、240、480、960、1920 μg/mL，每種濃度設5個平行孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，每孔加5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清，每孔加150 μL二甲基亞砜，在搖床上慢速振蕩10 min，于酶標儀波長490 nm處測定OD值，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=1-（給藥組OD值-調零孔OD值）÷（空白組OD值-調零孔OD值）×100%。計算化瘀降濁湯IC50的濃度。

2.3 Western blot檢測HK-2細胞蛋白表達

根據(jù)MTT實驗結果，將對數(shù)生長期HK-2細胞分為5組，正常組加3 mL正常培養(yǎng)液，其余4組加3 mL含10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，24 h后吸出培養(yǎng)基，正常組更換正常培養(yǎng)液，誘導組換為含10 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，中藥低劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯250 μg/mL培養(yǎng)液，中藥中劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯500 μg/mL培養(yǎng)液，中藥高劑量組換為含10 ng/mL TGF-β1+化瘀降濁湯1000 μg/mL培養(yǎng)液。24 h后吸出培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，無酶細胞消化液消化細胞后用RIPA提取總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉膜1 h，加一抗（E-cadherin、Smad3、Snail稀釋倍數(shù)為1∶5000），4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液清洗3次×10 min，加二抗（稀釋倍數(shù)為1∶8000），37 ℃孵育1 h，于Bio-Rad成像儀中加ECL顯影劑，Bio-Rad系統(tǒng)下曝光成像。應用Imag J對蛋白條帶進行灰度分析。計算相對光密度（OD）值[（處理組目標蛋白OD值/處理組內參蛋白OD值）÷（空白組目標蛋白OD值/空白組內參蛋白OD值）]。

2.4 免疫熒光檢測E-鈣黏蛋白表達

5組細胞按上述方法在6孔板中培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS沖洗3次×5 min，0.1%TritonX-100孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min。免疫染色封閉液室溫封閉1 h，吸出封閉液不洗，加入E-cadherin一抗（濃度為1∶200），4 ℃過夜沖洗3次×10 min，加入FITC標記山羊抗兔IgG（濃度為1∶100），室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次×10 min，DAPI室溫染色5 min，吸出，PBS沖洗3次×5 min。每孔各加入100 μL PBS和抗熒光淬滅封片液1滴，于高內涵細胞成像系統(tǒng)下拍照成像。

2.5 RT-PCR檢測HK-2細胞基因表達

5組細胞按上述方法培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，用Trizol從細胞中提取總RNA，用nanodrop測定RNA濃度，然后反轉錄為cDNA。用nanodrop測定cDNA濃度。變性：95 ℃、5 min；擴增：95 ℃、10 s，60 ℃、20s。50個循環(huán)；溶解：95 ℃、10 s，60 ℃、10 s；冷卻：40 ℃、30 s。同步進行對照管家基因GAPDH的定量檢測，采用2-ΔΔCT法計算基因表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析，滿足正態(tài)性和方差齊性時，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Dunnett's法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 化瘀降濁湯對轉化生長因子-β1誘導HK-2細胞增殖的影響

化瘀降濁湯能抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞增殖，并隨濃度的增加抑制率也相應增加，結果見圖1。根據(jù)統(tǒng)計結果得出IC50為472.017 μg/mL，為便于計算中劑量取500 μg/mL，低劑量為250 μg/mL，高劑量為1000 μg/mL。根據(jù)實驗結果分為5組?？瞻捉M不加任何藥物；誘導組：10 ng/mL TGF-β1；中藥低劑量組：10 ng/mL TGF-β1+250 μg/mL化瘀降濁湯；中藥中劑量組：10 ng/mL TGF-β1+500 μg/mL化瘀降濁湯；中藥高劑量組：10 μg/mL TGF-β1+1000 μg/mL化瘀降濁湯。

4.2 Western blot檢測化瘀降濁湯對轉化生長因子-β1誘導HK細胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達的影響

與誘導組比較，中藥中、高劑量組HK細胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見圖2、表1。

4.3 間接免疫熒光檢測化瘀降濁湯對轉化生長因子-β1誘導HK細胞E-cadherin、Smad3、Snail蛋白表達的影響

E-cadherin在HK-2細胞中表達較多，加入TGF-β1誘導后表達量減少，一定濃度的化瘀降濁湯作用后能夠增加E-cadherin蛋白的表達，與Western blot結果一致，見圖3。

4.4 RT-PCR檢測化瘀降濁湯對轉化生長因子-β1誘導HK細胞E-cadherin、Smad3、Snail mRNA表達的影響

與誘導組比較，中藥中、高劑量組HK-2細胞E-cadherin、Smad3、Snail mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

5 討論

對于泌尿系結石引起的機械性梗阻而言，一般只重視解除梗阻取出結石，而忽略了解除梗阻后對腎功能的進一步保護，臨床上由此導致腎單位隱性丟失的情況較為常見。腎小管-間質的損傷是各種原因所致進行性腎臟病進展的決定因素，而腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰的共同特征。EMT在腎間質纖維化過程中成纖維細胞的產生起著重要作用[5]。TGF-β能誘導并維持EMT[6]，而TGF-β/Smad通路是研究EMT的經典通路，由于TGF-β能增加E-cadherin相關抑制轉錄因子的表達，從而引起E-cadherin表達量減少。E-cadherin減少使細胞容易失去極性而與周圍細胞分離，因此其丟失被視為EMT的起始。Snail是含有鋅指結構的一類核轉錄因子，能與人類的鈣黏蛋白啟動子上的3種E-box結合，抑制E-cadherin轉錄[7]。Smad3磷酸化后進入細胞核內能夠活化EMT過程中相關基因的表達，目前關于Smad3的具體機制還不清楚，但Smad3能夠促進纖維化的看法是明確的。Smad3基因敲除后的小鼠能夠保護腎組織通過TGF-β介導的腎間質纖維化[8]。目前有研究認為，腎小管上皮細胞早期發(fā)生的EMT可以逆轉[9-10]。因此，研究中藥對TGF-β/Smad通路的影響有助于了解其保護腎功能的具體微觀機制。

中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院著名中西醫(yī)結合泌尿外科奠基人劉猷枋教授自20世紀60年代起開展中醫(yī)藥對上尿路結石及結石引起梗阻性腎病的研究。臨床上采用化瘀尿石湯治療上尿路結石。臨床和實驗研究表明，化瘀尿石湯治療上尿路結石（氣滯血瘀型）具有提高排石率、改善梗阻積水、減少復發(fā)率等作用；并可減少硝酸鈾酞所致大鼠腎損害模型的腎小管萎縮灶數(shù)及腎間質纖維增生程度[11]。劉猷枋主任根據(jù)古代中醫(yī)典籍認識、梗阻性腎病的臨床表現(xiàn)及西醫(yī)病理特點，認為該病病機總屬氣虛血瘀，在此病機認識基礎上，宏觀辨證與微觀辨證相結合，確立了益氣活血、降濁祛濕的治療原則，并在化瘀尿石湯基礎上酌減破氣破血之品，增加了益氣燥濕的力量，組成化瘀降濁湯。方中黃芪、丹參、莪術、桃仁、紅花均有抑制腎小管上皮細胞轉分化的作用[12-15]。

本實驗結果表明，通過誘導組與空白組對比，TGF-β1能誘導HK-2細胞發(fā)生EMT，化瘀降濁湯能抑制HK-2發(fā)生EMT后的細胞增殖，呈現(xiàn)出一定的量效關系。Western blot、RT-PCR檢測結果顯示，化瘀降濁湯能增加TGF-β1誘導后的HK-2細胞E-cadherin蛋白和基因表達、減少Smad3、Snail蛋白和基因表達，三者隨劑量的增加，表達強度隨之發(fā)生變化，呈現(xiàn)出一定的量效關系，間接免疫熒光測定E-cadherin蛋白表達與Western blot結果一致。而E-cadherin、Smad3、Snail是TGF-β/Smad信號途徑中的關鍵蛋白，表明化瘀降濁湯可能是通過調節(jié)HK-2細胞中的TGF-β/Smad信號途徑中的關鍵蛋白達到抑制甚至逆轉腎小管EMT，進而對腎小管間質纖維化起到保護作用，從而實現(xiàn)保護腎功能的目的。

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