陳杏媛，郭琴華

(吉安市中心人民醫(yī)院，江西　吉安343000)

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·檢驗與臨床·

結(jié)核桿菌三種實(shí)驗方法的應(yīng)用評估

陳杏媛，郭琴華

(吉安市中心人民醫(yī)院，江西吉安343000)

摘要：目的比較痰涂片法、實(shí)時熒光定量PCR法和免疫結(jié)核抗體（金標(biāo)法）檢測對結(jié)核病的診斷意義。方法選取2015年7月至2015年10月在我院診療疑似或確診患者172例，進(jìn)行涂片抗酸染色、實(shí)時熒光定量PCR法檢測和采集血樣進(jìn)行免疫結(jié)核抗體檢測。結(jié)果172例檢測樣本中，抗酸染色痰液標(biāo)本陽性例數(shù)只有20例，陽性率為11.6%。實(shí)時熒光定量PCR法陽性例數(shù)55例，陽性率31.2%。免疫結(jié)核抗體（金標(biāo)法）陽性例數(shù)為87例，陽性率為50.6%。結(jié)論三種方法中，以結(jié)核抗體陽性率最高，實(shí)時熒光定量PCR法次之，抗酸染色法陽性率最低。如果三種方法聯(lián)合運(yùn)用，相互佐證，可提高準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌；檢測方法

結(jié)核桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺結(jié)核為多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病，據(jù)WTO報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，約300萬人死于該病。近年來，因艾滋病、吸毒等社會原因及免疫制劑的應(yīng)用，其發(fā)病率呈上升趨勢[1]，在我國一些地區(qū)結(jié)核病已在感染性長期發(fā)熱的病因中上升至首位[2，3]。當(dāng)前，對結(jié)核病的預(yù)防、診斷以及臨床治療已經(jīng)成為我國重點(diǎn)解決的醫(yī)學(xué)課題[4]。通過早診斷、早治療，絕大多數(shù)的結(jié)核病患者均可以治愈[5]。長期以來，結(jié)核病的實(shí)驗室診斷是結(jié)核病防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)[6]。鑒定結(jié)核桿菌的方法有很多，但各種方法的特異性和敏感性各不相同。本人對痰涂片染色法、實(shí)時熒光定量PCR法、免疫結(jié)核抗體（金標(biāo)法）3種方法進(jìn)行對比研究，以評價各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和對臨床的應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1．1材料收集自2015年7月至2015年10月期間在我院診療疑似或確診結(jié)核病的患者標(biāo)本172例。涂片法和實(shí)時熒光定量PCR法的標(biāo)本為痰液。囑患者留取晨痰2~5ml (結(jié)核患者需停抗結(jié)核藥3天）結(jié)核抗體檢測則采靜脈血2ml。

1.2檢測方法

1.2.1涂片染色鏡檢是臨床常用的簡易快速的檢查方法：取痰或其他已處理好的標(biāo)本0.1ml，于載玻片上均勻涂抹成2cm×2.5cm橢圓形范圍，以自然干燥和火焰固定后，進(jìn)行抗酸染色，采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司的結(jié)核染色液。染色步驟：⑴石碳酸復(fù)紅溶液染色20min；⑵5%鹽酸酒精脫色3min；⑶亞甲基藍(lán)溶液染色30s。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR法（試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因公司產(chǎn)品）⑴取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍體積4%NaOH液化痰液，30min后吸1.5ml置EP內(nèi)。⑵在金屬浴內(nèi)100℃（3~5min）12000r/min，棄上清液。⑶加入生理鹽水約1.5ml混勻振蕩，離心棄上清液。⑷重復(fù)洗滌1次。⑸加入40μl DNA提取液在金屬浴100℃10min。⑹12000r/ min離心5min標(biāo)本處理完畢。⑺離心取上清2μl 至PCR反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)管置定量PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：93℃2min預(yù)變性，93℃ ations in cardiovascular diseases：life style intervention [J]. Biomed Res Int，2014：801896. doi.10.1155/2014/801896.

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1.2.3免疫結(jié)核分枝桿菌抗體檢測（金標(biāo)法）細(xì)菌在體內(nèi)生長繁殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，包括IgA、IgE、IgM、IgG，檢測這些抗體可幫助診斷分枝桿菌感染。將結(jié)核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原分離純化，點(diǎn)樣并固化在硝酸纖維膜上。膜上TB抗原捕獲人血清樣品中結(jié)核分枝桿菌抗體，被捕獲的結(jié)核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白（SPA）能與IgG特異性結(jié)合），形成紅色斑點(diǎn)，根據(jù)是否出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即可判斷陰、陽性結(jié)果從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌抗體標(biāo)本要求必須使用新鮮的血清標(biāo)本。血漿標(biāo)本必須用玻璃剝離纖維蛋白，保證血清無混濁沉淀，以免吸入導(dǎo)致反應(yīng)膜孔阻塞（試劑為上海奧普生物醫(yī)藥有限公司提供）。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析運(yùn)用SPSS 14.0軟件采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

結(jié)核桿菌3種檢測方法結(jié)果比較：3種方法中，免疫結(jié)核抗體（金標(biāo)法）陽性率最高，達(dá)50.6%。其次為實(shí)時熒光定量PCR法，陽性率為32.2%。陽性率最低為痰涂片法，陽性率僅為11.6%。三種檢測方法比較，陽性率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　3種檢測方法的結(jié)果

3　討論

對于肺結(jié)核的實(shí)驗室診斷，痰涂片法是檢測抗酸桿菌最普遍使用的方法，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、特異性高，但陽性率低，無法滿足對結(jié)核病的診斷需求[7]。實(shí)時熒光定量PCR法可在1d內(nèi)完成臨床樣品處理、核酸提取和檢測全過程，具有反應(yīng)快速、特異性好、靈敏度高等許多優(yōu)點(diǎn)。通過比較，實(shí)時熒光定量PCR法和傳統(tǒng)的涂片法，兩者有較好的一致性；在不選擇病例的前提下，前者的陽性率比后者高3倍左右。而且定量PCR是在完全封閉狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴(kuò)增產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性，結(jié)果真實(shí)可靠[8，9]。但該方法相對價格稍高，需較為昂貴的儀器和設(shè)施。免疫結(jié)核抗體檢測（金標(biāo)法）是一種簡單、快速的檢測方法，且陽性率較高（50.6%）。而且試劑和樣品用量極少，無需儀器設(shè)備，簡化了繁瑣的常規(guī)操作過程，同時也減小了因操作引起的誤差。免疫結(jié)核抗體檢測（金標(biāo)法）簡便、快速、適應(yīng)單人份測定的特點(diǎn)，尤其適用于基層醫(yī)院。但是其靈敏度稍低，有一定的假陽性和假陰性，特異性稍差，結(jié)果判斷帶有一定的主觀性，缺乏有效的質(zhì)控手段，其靈敏度和敏感性均有待提高[10]。如果三種方法聯(lián)合運(yùn)用，相互佐證，尤其對臨床醫(yī)師高度懷疑為結(jié)核的病例，當(dāng)用一種檢測方法為陰性時，就應(yīng)采用其它兩種方法重新檢測，從而使結(jié)核患者的檢測準(zhǔn)確性得以明顯提高，多方面滿足臨床需要，提高肺結(jié)核的診斷水平。

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中圖分類號：R446.19，R825.2，R378.91+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0373-02

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.036

(收稿日期2016-01-11；修回日期2016-03-11)45s→55℃60s10個循環(huán)，93℃30s→55℃45s30個循環(huán)。擴(kuò)增過程中儀器實(shí)時檢測熒光強(qiáng)度并分析增長曲線，根據(jù)Ct計算出樣本中DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：增長曲線呈S型，最強(qiáng)熒光值增高20單位以上。 2016-03-14；修回日期2016-04-17)