楊洋，龔甜，殷小龍，徐剛，張艷妮

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院，江西　南昌330006；2、江西省疾病預防控制中心，330029)

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·論著·

2012年江西省兒童急性出血性結膜炎病原學特征分析

楊洋1，龔甜2，殷小龍1，徐剛2，張艷妮2

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006；2、江西省疾病預防控制中心，330029)

摘要：目的了解2012年江西省兒童急性出血性結膜炎(AHC)病原學特征，為其防治提供科學依據(jù)。方法采集2012年江西省急性出血性結膜炎患兒44例結膜拭子標本，并運用PCR和RT-PCR方法對這44份結膜拭子標本同時進行腸道病毒70型、柯薩奇病毒24型變異株和腺病毒三種病毒檢測。結果2012年江西省兒童流行性出血性結膜炎流行高峰在5-7月份；PCR和RT-PCR檢測結果為腺病毒陽性31份。結論2012年江西省兒童急性出血性結膜炎病原體主要為腺病毒。

關鍵詞：急性出血性結膜炎；腺病毒；腸道病毒70型；病原學

急性出血性結膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis，AHC)俗稱紅眼病，是近40年來世界暴發(fā)流行的一種新型急性病毒性眼??；其病原體為腸道病毒70型(Human Enterovirus 70，HEV70)、柯薩奇病毒A組24型的一個變種(Coxsackievirus A24 variant，CVA24v)和腺病毒[1]，由于其傳染性極強，又缺乏有效的治療方法，AHC會嚴重影響當?shù)亟?jīng)濟，并會消耗大量的醫(yī)療衛(wèi)生資源。我國自1971年上海、北京等地區(qū)發(fā)生大流行以來，就不斷發(fā)生過流行。臨床上不同病毒引起的AHC不易鑒別，因此及時了解病原對其防治具有重要意義。本研究對2012年江西省兒童急性出血性結膜炎進行病原學檢測和分析，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1　材料與方法

1.1標本采集和處理標本采自2012年2月至11月經(jīng)江西省兒童醫(yī)院眼科門診診斷為急性出血性結膜炎的病例44例，用無菌棉拭子擦拭患者的結膜，結膜拭子標本保存在3ml病毒標本運輸液(含5%牛血清、終濃度2000U/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素和25U/ml制霉菌素的細胞培養(yǎng)液)。

1.2病毒PCR和RT-PCR檢測

1.2.1病毒核酸提取取結膜拭子標本200μl，采用Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit （Cat No：57704）提取病毒RNA和DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2HEV70、CVA24v和腺病毒基因檢測對提取的核酸同時進行HEV70、CVA24v和腺病毒三種病毒核酸檢測，檢測引物[2]由上海生工合成，引物具體序列如下：

HEV70：上游引物為5'-AGGGATTCACCAGA CATTGG-3'，下游引物為5'-ATTTTCCACCAGGCA CTCTG-3'，產(chǎn)物大小為242bp

CVA24v：上游引物為5'-GTGAGTGCTTGCCC AGATTT-3'，下游引物為5'-CTCCACTAGTGAGCG GTGTG-3'，產(chǎn)物大小為184bp

腺病毒：上游引物為5'-GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC-3'，下游引物為5'-CAGCACSCCI CGRATGTCAAA-3'，產(chǎn)物大小為301bp。

1.2.3擴增反應

1.2.3.1HEV70和CVA24v RT-PCR反應采用QIAGEN公司的One Step RNA PCR Kit（Cat No：210212）試劑盒進行逆轉錄擴增，反應體系為25μl，其中RNA模板5μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP 1μl，Taq DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶酶1μl，RNA酶抑制劑0.1μl，上下游引物各0.5μl，蒸餾水11.9μl。反應條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環(huán)如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，35次循環(huán)；72℃10min。

1.2.3.2腺病毒PCR反應采用Promega公司的Go Taq Green Master Mix（Cat No：M7122）試劑盒進行核酸擴增，反應體系為25μl，其中DNA模板5μl，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5μl，上下游引物各0.5μl，蒸餾水6.5μl反應條件：94℃5min，PCR循環(huán)如下：94℃40s，55℃40s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。

PCR擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖電泳，在自動凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。

1.3統(tǒng)計方法采用Microsoft Excel 2003對數(shù)據(jù)進行整理和分析。

2　結果

2.1流行病學特征2012年江西省5歲及以下兒童急性出血性結膜炎報告發(fā)病數(shù)共151例，發(fā)病呈常態(tài)散發(fā)水平。采集標本各月份均有發(fā)病，均為年初開始發(fā)病，于4月至7月份和11月至12月出現(xiàn)兩個高峰，詳見圖1。

圖1　2012年江西省5歲及以下兒童急性出血性結膜炎月報告發(fā)病數(shù)

2.2病毒核酸檢測情況本研究采集的5歲以下兒童44份結膜拭子標本中，病毒腺病毒核酸陽性31份，陽性率為70.45%，HEV70和CVA24v檢測結果均為陰性。

3　討論

AHC首次在1969年爆發(fā)于非洲加納隨后在世界范圍內(nèi)發(fā)生多次大流行，是40多年來世界流行的一種新型急性病毒性眼病[3]。

本研究于2012年2月-11月期間每周一次赴江西省兒童急性出血性結膜炎的采集患兒結膜拭子，并對結膜拭子同時檢測HEV70、CVA24v和腺病毒三種病毒核酸。國家傳染病網(wǎng)絡直報系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析表明2012年江西省兒童急性出血性結膜炎流行高峰在4月至7月份和11月至12月，本研究病毒核酸檢測結果為44份結膜拭子標本中31份核酸陽性，且均為腺病毒，提示江西省2012年兒童急性結膜炎病原主要為腺病毒。目前，國內(nèi)關于腺病毒感染的報道較少，在我國1994年AHC流行期間，3型腺病毒占病毒陽性者的22%[4]。本研究結果不同于我國既往研究自1971年以來至2010年AHC流行優(yōu)勢病原體以CVA24v為主[5]，可能是由于以往報道主要都是關于的AHC的暴發(fā)疫情病原學研究，因為根據(jù)研究證明，我國AHC的暴發(fā)多是由CVA24v[6-10]所導致的，由HEV70和人腺病毒所致的AHC的暴發(fā)報道較少，而本研究為對兒童AHC持續(xù)近一年病例的病原學監(jiān)測研究。

AHC具有隔幾年出現(xiàn)一次發(fā)病高峰的現(xiàn)象，江西省與我國于2010年同步出現(xiàn)一次流行高峰[5，11，12]，并且有研究表明[4]AHC流行間隙期內(nèi)腺病毒占病毒陽性的比率逐年上升，腸道病毒比率則逐年下降，腺病毒是AHC流行間隙期內(nèi)急性結膜炎的主要病原，而AHC也是急性結膜炎的一種。因此，本研究得出江西省2012年兒童急性結膜炎病原主要為腺病毒，提示2012年為江西省兒童AHC流行間隙期，與王曉芳等報道一致。由于本研究標本數(shù)不多，因此及時掌握AHC病原譜構成變化，是否能為AHC出現(xiàn)新一輪發(fā)病高峰預測預警提供科學依據(jù)，有待進一步擴大對AHC甚至對急性結膜炎進行的病原學監(jiān)測研究闡明。

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·論著·

中圖分類號：R777.31

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0277-02

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.006

基金項目：江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ11356)；江西省衛(wèi)生廳科研計劃項目(20113116)

作者簡介：楊洋，女，1981年1月生，碩士，主要從事兒童眼科疾病臨床診斷和研究。

(收稿日期2016-03-22；修回日期2016-05-24)

Etiology analysis in children with acute hemorrhagic conjunctivitis in Jiangxi province in 2012

YANG Yang1，GONG Tian2，YIN Xiaolong1，et al. 1.The Second Affiliated Hospital to Nanchang University，Nanchang 330006；2.Jiangxi Province Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Abstract：Objective To understand the pathogens spectrum in the children with acute hemorrhagic conjunctivitis (AHC) in Jiangxi province in 2012，and provide the scientific evidence for its prevention and treatment. Methods The specimens of conjunctival swabs were collected from 44 children with AHC in 2012，and the virus nucleotide of enterovirus type 70，coxsackievirus A24 variant and adenovirus were detected with PCR and RT-PCR. Results Epidemic peaks of acute hemorrhagic conjunctivitis in children arose in the 5-7 months in Jiangxi province in 2012；the 31 samples detected with PCR and RT-PCR were adenoviruspositive. Conclusion The dominant pathogens of acute hemorrhagic conjunctivitis in children was adenovirus in Jiangxi province in 2012.

Key words:Acute hemorrhagic conjunctivitis；Adenovirus；Human Enterovirus 70；Pathogenic