王多嬌，顏春榮，徐春祥（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008）

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UPLC-MS/MS測定牛奶中9種青霉素

王多嬌，顏春榮，徐春祥*
（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008）

摘要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)離子監(jiān)測模式同時測定牛奶中9種青霉素類抗生素（包括羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、乙氧柰胺青霉素、苯唑青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、甲氧苯基青霉素）殘留量的檢測方法。樣品采用乙腈沉淀蛋白、脫脂后，過HLB小柱凈化、富集。以0.01 mol/L乙酸銨水（甲酸調(diào)節(jié)pH4.5）-乙腈梯度洗脫，經(jīng)AgilentEclipseplusC18色譜柱（2.1×100 mm，粒徑1.8 μm）分離后，采用MRM模式進(jìn)行定量定性分析。結(jié)果：結(jié)果表明9種抗生素在0.1 μg/L～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，高中低濃度回收率在67.7%～92.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）小于15%，各組分定量限為0.1μg/kg～4μg/kg。

關(guān)鍵詞：牛奶；青霉素；殘留；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

目前，青霉素殘留的檢測方法主要有傳統(tǒng)的微生物法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。微生物法耗時長，操作復(fù)雜，專屬性不強(qiáng)，只能測定青霉素總量［3］。酶聯(lián)免疫法，操作簡便，但是會存在假陽性，適于篩查工作，同時微生物法和酶聯(lián)免疫法都不能確定為何種青霉素，也不適于定量分析。高效液相色譜法適于分析基質(zhì)單一、含量較高的樣品，而且青霉素類采用液相色譜進(jìn)行測定時，需要進(jìn)行衍生化［4-5］，存在操作繁瑣、重現(xiàn)性差、靈敏度不高等問題。隨著高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的普及，該方法被廣泛應(yīng)用于青霉素類殘留的檢測［6-8］。因而本文擬建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定牛奶中青霉素類抗生素的方法。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料

市售牛奶。

1.1.2試劑

羥氨芐青霉素（純度98.0%）、氨芐青霉素（純度98.5%）、鄰氯青霉素（純度93.5%）、雙氯青霉素（純度97.5%）、乙氧柰胺青霉素（純度91.0%）、苯唑青霉素（純度92.0%）、芐青霉素（純度97.2%）、苯氧甲基青霉素（純度98.8%）標(biāo)準(zhǔn)品：均購于Dr.Ehrenstorfer公司；甲氧苯基青霉素（純度91.4%）標(biāo)準(zhǔn)品：購于USP Rockville.MD公司；乙腈為色譜純；醋酸銨、甲酸為分析純；水為超純水；OasisHLB固相萃取小柱（60mg/3mL）：美國Waters公司。

0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8.5）配制：稱取8.7 g磷酸氫二鉀，超純水溶解，稀釋至1 000 mL，用磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)pH至8.5。

1.1.3儀器

Agilent Technologies 1290 Series超高壓液相色譜系統(tǒng)：美國安捷倫科技有限公司；AB API 4000 plus串聯(lián)四極桿質(zhì)量分析儀：美國AB SCIEX公司；Milli-Q純水儀：美國Millipore公司；ZD-2型調(diào)速多用振蕩器：江蘇省金壇市國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；固相萃取裝置：美國Supelco公司。

1.2方法

1.2.1樣品前處理

稱取10 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋2 min，4℃下8 000 r/min離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至另一個50 mL離心管中，加入20 mL正己烷，渦旋30 s，4℃下8 000 r/min離心3 min，棄去正己烷層；下層溶液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，37℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈。

立即向除去乙腈的雞心瓶中加入15 mL磷酸鹽緩沖液，渦旋溶解殘?jiān)?。將樣品提取液過經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB小柱，依次用3 mL磷酸鹽緩沖液、3 mL水淋洗，抽干，用3 mL乙腈洗脫小柱。將洗脫液于37℃下氮?dú)獯蹈?，? mL初始比例流動相溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm濾膜過濾后，用UPLC-MS/MS分析測定。

1.2.2色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18（2.1×100 mm，粒徑1.8 μm）；流動相：組分A是0.01 mol/L乙酸銨水溶液（甲酸調(diào)節(jié)pH4.5），組分B是乙腈，梯度洗脫，0 min～1 min 98%A，1 min～2min 98%A下降為90%A，2min～5 min 90%A下降為70%A，5 min～7 min 70%A下降為60%A，7 min～7.1 min 60%A上升為98%A，7.1 min～10 min保持98%A；流速：0.2 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：MRM模式；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：600℃；碰撞氣壓力：0.082 8 MPa；霧化氣壓力：0.552 MPa；氣簾氣壓力：0.207 MPa；輔助氣壓力：0.586 MPa；9種青霉素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1　9種青霉素的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1　MS parameters for the analysis of nine penicillins

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

多數(shù)青霉素類化合物在酸性條件下不穩(wěn)定，且用0.1%三氯乙酸沉淀牛奶中蛋白質(zhì)時，沉淀效果不好，因此排除0.1%三氯乙酸作為沉淀劑。青霉素的降解主要是內(nèi)酰胺環(huán)在水、酸、堿、重金屬等條件下的開環(huán)或分子重排，因而樣品中水分的含量對其穩(wěn)定性影響較大，即含水量越高，越易發(fā)生降解［9］，因而排除無機(jī)鹽如乙酸鋅-亞鐵氰化鉀等沉淀蛋白的方法?？紤]到青霉素的溶解性及沉淀效果，比較了甲醇和乙腈兩種沉淀試劑，乙腈提取回收率較高，因而選擇乙腈作為提取溶劑，但乙腈提取后，不能直接進(jìn)行固相萃取，需濃縮后轉(zhuǎn)換為無機(jī)溶劑。牛奶中含有一定的脂肪，因而在乙腈提取液中加入一定量的正己烷脫脂。參照文獻(xiàn)［7，10］以pH8.5的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液作為乙腈提取后的轉(zhuǎn)換溶液及淋洗液。復(fù)溶樣品時，應(yīng)采用初始比例的流動相溶解樣品，否則氨芐青霉素易形成雙峰。

2.2色譜條件的優(yōu)化

比較0.01 mol/L乙酸銨水（甲酸調(diào)節(jié)pH4.5）-乙腈、0.01 mol/L乙酸銨水-乙腈和0.1%甲酸-乙腈流動相體系，發(fā)現(xiàn)在ESI+模式下，乙酸銨的加入有助于形成［M+H］+的分子離子峰，抑制［M+Na］+、［M+K］+加合離子的形成，提高檢測靈敏度；但是若流動相pH達(dá)不到4.5，氨芐青霉素、羥氨芐青霉素會有雙峰或前沿峰現(xiàn)象；而甲酸對青霉素類抗生素的離子化有促進(jìn)作用，故選擇0.01mol/L乙酸銨水溶液（甲酸調(diào)節(jié)pH4.5）-乙腈作為流動相。在上述色譜及質(zhì)譜條件下，圖1為9種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖。

圖19　種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1　MRM chromatograms of nine penicillin standard solution

表3　9種青霉素添加回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）Table 3　Spiked recoveries and precisions of 9 penicillins in milk

各組分出峰順序依次為：羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、甲氧苯青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、乙氧柰胺青霉素、雙氯青霉素。

2.3方法的驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

測定牛奶中青霉素時，存在一定的基質(zhì)效應(yīng)［11］，因而采用基質(zhì)標(biāo)曲進(jìn)行定量分析以盡量減少基質(zhì)效應(yīng)干擾。以空白牛奶樣品的提取液作為稀釋溶液，配成濃度為0.01 μg/L～100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測組分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，待測組分的濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系良好。以信噪比（S/ N）為3確定方法的檢出限。結(jié)果見表2。

表2　9種青霉素線性方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2　Linear regression equations with correlation coefficients and limits of detection of 9 penicillins

2.3.2精密度和回收率試驗(yàn)

用空白牛奶樣品進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，樣品中添加0.2、0.5、1.0、2.0 μg/kg 4個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)后，搖勻，然后按本方法進(jìn)行提取、凈化和測定，其回收率和精密度見表3。

從表3中回收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法回收率為67.7%～92.8%，4個添加水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.78%～12.8%。

3　結(jié)論

本文建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時快速測定牛奶中9種青霉素的方法。樣品經(jīng)乙腈提取、HLB小柱凈化、富集后，進(jìn)行分離測定，同時滿足了定性定量分析的要求。各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均滿足分析測定要求，可滿足實(shí)際檢測工作的需要。但是，在實(shí)際樣品的測定中，近200批次牛奶樣品均未檢出陽性樣品。這可能與青霉素類易降解的性質(zhì)有關(guān)；也可能一些不法商販在牛奶中加入了β-內(nèi)酰胺酶，將其中的青霉素變?yōu)槊附獯x產(chǎn)物，使得無法測到青霉素。這提示我們，在以后的牛奶中青霉素監(jiān)測工作中，可以同時監(jiān)測青霉素代謝產(chǎn)物及β-內(nèi)酰胺酶，但是相應(yīng)的食品安全標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)也應(yīng)跟上社會的發(fā)展。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.037

作者簡介：王多嬌（1985—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品安全分析。

*通信作者：徐春祥（1970—）。

收稿日期：2015-05-11

Simultaneous Determination of Nine Penicillin Residues in Milk by UPLC-MS/MS

WANG Duo-jiao，YAN Chun-rong，XU Chun-xiang*

（Jiangsu Provincial Food and Drug Supervision and Inspection Institute，Nanjing 210008，Jiangsu，China）

Abstract：A ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry method was developed for the analysis of nine penicillin residues（amoxicillin，ampicillin，cloxacillin，dicloxacillin，nafcillin，oxacillin，gpenicillin，penicillin，methicillin）in milk，simutaneously.Protein and fat in the samples were removed by acetonitrile and n-hexane respectively，then the samples were purified on HLB column and concentrated under N2.The analytes were separated on an Agilent Eclipse plus C18column（2.1×100 mm，dp1.8 μm）with gradient elution consisted of 0.01 mol/L ammonium acetate（pH4.5）and acetonitrile，and analyzed under the mode of MRM.The results showed good linearity in the ranges of 0.1 μg/L-100 μg/L.The recoveries were between 67.7%and 92.8%，and the values of the RSD（n=6）were lower than 15%for all the analytes.The limits of quantitatitation（LOQ）for the analytes range from 0.1 μg/kg to 4 μg/kg.The method was suitable to detect penicillins in milk simultaneously with good accuracy and reputability.

Key words：milk；penicillin；residue；UPLC-MS/MS青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱，主要對革蘭氏陽性菌有效，是目前治療奶牛乳腺炎的首選藥物，但是不規(guī)范用藥會造成藥物在動物組織及牛奶中的殘留。殘留的青霉素不僅會破壞人腸道菌群平衡，降低人體免疫力［1］，而且極易發(fā)生降解，其降解產(chǎn)物與蛋白結(jié)合后，會誘發(fā)過敏反應(yīng)［2］，因而有必要加強(qiáng)對青霉素殘留的監(jiān)測。