肖自添，劉 明，何煥清

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一株野生烏芝的鑒定及其生物學特性研究

肖自添，劉 明，何煥清

（廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州510640）

摘 要：從廣東省廣州市白云山內(nèi)采集到一株野生假芝，對其子實體進行了組織分離，獲得純菌絲體。通過形態(tài)學和ITS序列鑒定，確認該菌株屬于靈芝科假芝屬真菌，與烏芝（Amauroderma rugosum）同源性最高，編號為白云烏芝（BYWZ）。首次開展烏芝生物學特性研究，結果表明，該菌株菌絲生長的最適碳源為果糖，最適氮源為麩皮，最適生長溫度為30℃，最適pH值范圍為7.0～8.0。該研究為烏芝的人工馴化栽培和開發(fā)利用奠定基礎，對開發(fā)利用國內(nèi)野生真菌資源具有重要意義。

關鍵詞：野生假芝；鑒定；ITS序列；人工馴化

靈芝（Ganoderma lingzhi，舊稱Ganoderma lucidum）作為“藥用菌之王”，其保健、藥用功效早已得到世界的認可。在我國已經(jīng)有2000多年的記載和應用歷史［1］，近年來，隨著人們保健意識的增強，對靈芝產(chǎn)品的需求日益增加，其研究也日趨深入和廣泛，使得靈芝已成為國內(nèi)外學術界矚目的研究課題［2-4］?！办`芝”其實是人們對靈芝科不同靈芝種屬的一個統(tǒng)稱，廣義的靈芝包括靈芝科屬的很多種類，目前已報道有超過250種［5］，分布在世界各地。假芝屬是靈芝科的一個重要亞屬，在靈芝科家族中占有一席之地，目前報道假芝屬有22個種［6］，全部分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，其中皺蓋假芝（Amauroderma rude）、烏芝（Amauroderma rugosum）、黑假芝（Amauroderma nigrum）、廈門假芝（Amauroderma amoiensis）等已經(jīng)明確具有藥用價值，在抗腫瘤、抗癌、抗氧化、消炎和提高免疫機能等方面起到積極作用［7-11］。但是，目前世界范圍內(nèi)對假芝屬真菌的研究報道極少，與赤芝和紫芝相比相差甚遠。最新的研究結果表明烏芝具有消炎、抗氧化、抑腫瘤等作用［8，12-13］，在馬來西亞還作為一種傳統(tǒng)的民間中草藥用于治療神經(jīng)性癲癇等，在我國華南地區(qū)也有采摘、銷售野生烏芝的傳統(tǒng)習慣，不僅價格高，且常常供不應求。但是目前關于烏芝人工馴化栽培的報道極少，野生烏芝資源仍未被開發(fā)利用。本研究從廣州市白云山采集分離得到一株野生假芝，經(jīng)鑒定為具有藥用價值的烏芝（Amauroderma rugosum），成功分離獲得純菌絲體，首次對其生物學特性進行研究，為烏芝的人工馴化栽培奠定基礎，現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株采集于廣東省廣州市白云山自然風景區(qū)內(nèi)，經(jīng)廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所分離、純化并保存，編號為BYWZ。PCR引物由上海英俊生物技術有限公司合成，DNA提取試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司。

母種培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、瓊脂粉2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、VB1 0.003%，蒸餾水1 000 mL。用于組織分離和保藏。

碳源試驗培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，VB1 0.003%，2%碳源，水1 000 mL。分別用2%葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉替代其中的碳。

氮源試驗培養(yǎng)基：葡萄糖2%，瓊脂2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，VB1 0.003%，0.2%氮源，水1 000 mL。分別用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、麩皮、豆粨粉、黃豆粉等有機氮和氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等無機氮替代氮源。

溫度試驗培養(yǎng)基：同母種培養(yǎng)基。

pH值試驗培養(yǎng)基：同母種培養(yǎng)基，并用1N鹽酸和1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。

1.2 菌種的分離與培養(yǎng)

產(chǎn)婦會陰完好率和產(chǎn)婦及其家屬滿意度兩方面進行評定。產(chǎn)婦會陰完好情況分為會陰完好、會陰輕度損傷和損傷較嚴重,比較兩組會陰完好率。產(chǎn)婦及其家屬滿意情況分為比較滿意、一般滿意和不滿意,比較兩組產(chǎn)婦及其家屬滿意度。在兩組患者陰道分娩結束后,對兩組產(chǎn)婦的產(chǎn)后恢復情況進行比較[3]。

采用組織分離法，在無菌條件下將經(jīng)表面消毒的野生假芝鮮子實體用手術刀切開，在菌蓋和菌柄交界處切取約0.2 cm2挑的組織塊，接種于母種試管培養(yǎng)基中央，置于25（±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。獲得菌絲體純培養(yǎng)編號為BYWZ，長滿后再轉(zhuǎn)管1次，于4℃冰箱中保藏。

1.3 菌株的形態(tài)鑒定

采用插片培養(yǎng)法觀察BYWZ菌株的菌絲形態(tài)。將經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基，在無菌條件下分裝到直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，冷卻，制備成固體平板。然后將活化好的菌種塊（0.5 cm2）接入到平板中央，然后用鑷子夾起一片已經(jīng)高壓滅菌的蓋玻片以45°角插入平板中，培養(yǎng)皿封口后置于25（± 1）℃的恒溫箱中培養(yǎng)。待菌絲長到蓋玻片1/3處后將蓋玻片取出，進行顯微觀察。

1.4 菌株的分子鑒定

1.4.1 DNA的提取 在無菌條件下將活化好的菌種接入已制備好的平板培養(yǎng)基中，25（±1）℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后小心刮取菌絲體，-20℃保存，備用。

采用改良CTAB法提取總DNA。以0.7%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量，用超微量紫外可見分光光度計檢測DNA濃度及純度。

1.4.2 ITS序列測定 PCR擴增反應在基因有限公司的Veriti型PCR擴增儀上進行，ITS-PCR反應體系（50 μL）為：基因組DNA 2 μL（模板），1×2 mmol/L dNTPs 5μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反引物（10 μmol/L）各1.5 μL（由上海英俊生物技術有限公司合成），2條引物分別為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC），KOD-Plus-Neo （1 U/μL）1 μL（購自東洋紡生物科技有限公司），10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，補充ddH2O至50 μL。

1.4.3系統(tǒng)發(fā)育樹構建 將菌株測序后的ITS基因序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中，通過BLAST程序與GenBank和CBOL中的ITS基因序列進行同源性比較，利用MEGA 6.06軟件，距離法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Kimura2-parameter法計算遺傳距離，重復抽樣l 000次分析系統(tǒng)樹各分支的置信度。

1.5 生物學特性研究

碳源、氮源、溫度、pH試驗均采用平板（直徑為9 mm）培養(yǎng)方法，3次重復。無菌條件下在平板中央接種已活化的菌種塊0.5 cm2，并在菌塊下方劃一刻度作為測量起始線，封口后置于25（± 1）℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每天觀察菌絲生長情況并劃線，待其中一組長滿平板即停止培養(yǎng)，并計算菌絲日均長速，菌絲生長速度=菌落半徑增長度（mm）/培養(yǎng)時間（d）。溫度試驗置于不同溫度培養(yǎng)箱進行避光培養(yǎng)。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 子實體形態(tài)特征

供試菌株木栓質(zhì)，為1年生擔子果，菌蓋腎形至近半圓形，直徑3～10 cm，厚0.5～1.5 cm，灰褐色至黑色，被短絨毛，具顯著同心環(huán)紋，無似漆樣光澤，邊緣鈍、?。▓D1A、C，封二）；菌管新鮮時白色，傷變血紅色，然后迅速變黑色（圖1B，封二）；菌柄偏生或側(cè)生，圓柱形，實心，長4～12 cm，粗0.8～1.5 cm，與菌蓋同色，有細微絨毛。結果與畢志樹《廣東大型真菌志》中假芝屬真菌的子實體特征一致。

2.2 菌絲體形態(tài)特征

供試菌株的菌落初為白色，邊緣規(guī)則，呈放射狀向外擴張，致密（圖2A，封二），隨著培養(yǎng)時間的增加，菌落開始分泌褐色分泌物，菌落變紅褐色，至全黑褐色（圖2B，封二）。在40倍和100倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲無色透明，薄壁，有隔膜，側(cè)生或末端分支，未見鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象（圖2C，封二）。

圖3 供試菌株BYWZ的ITS序列擴增結果

圖4 供試菌株BYWZ測序結果

圖5 基于不同假芝屬菌株rDNA-ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 分子生物學鑒定

經(jīng)引物ITS1和ITS4擴增，所得ITS序列產(chǎn)物片段大小在500 bp左右（圖3），送樣測序擴增結果的目的片段為637 bp（圖4）。將測序后的結果在Genebank上進行比對，發(fā)現(xiàn)供試菌株與假芝屬烏芝（Amauroderma rugosum，登陸號：KJ654361.1）的物種相似性最高，達99%。進一步利用MEGA6.06軟件，以供試菌株與CBOL和GenBank中已知假芝屬（Amauroderma）菌株ITS片段序列構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖5，供試菌株與烏芝（Amauroderma rugosum）親緣關系最近。結合形態(tài)學和ITS序列鑒定，可以確定本野生菌株為靈芝科假芝屬烏芝，編號為白云烏芝（BYWZ）。

2.4 不同碳源對烏芝菌絲體生長的影響

由表1可知，以果糖為碳源時，烏芝菌絲長勢好，長速最快，達5.25 mm/d，其次是葡萄糖、蔗糖；以乳糖為碳源時的菌絲生長速度最慢，僅有1.93 mm/d，顯著低于其他處理，而以淀粉為碳源時則菌絲長勢最弱，麥芽糖長勢和長速居中。綜上結果，果糖是該菌株菌絲生長的最適碳源，葡萄糖次之。

表1 不同碳源對BYWZ菌絲生長情況比較

2.5 不同氮源對烏芝菌絲體生長的影響

從表2可以看出，以麩皮、氯化銨等9種不同物質(zhì)為氮源培養(yǎng)時，烏芝菌絲均能正常生長，其中以麩皮為氮源時生長速度最快，達4.48 mm/d，其次為豆粨粉、黃豆粉；以蛋白胨和酵母膏為氮源時，長速最慢，為2.03 mm/d，極顯著低于其他處理。以無機氮源硫酸銨、硝酸銨、氯化銨為氮源時，長速居中，三者沒有差異。以麩皮、豆粨粉、黃豆粉為氮源時菌絲長勢最好，其次是酵母膏、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。綜上結果，麩皮是該菌株菌絲生長的最適氮源，其次是豆粨粉。

表2 不同氮源對BYWZ菌絲生長情況比較

2.6 不同pH值對烏芝菌絲體生長的影響

由表3可知，烏芝菌絲可生長的pH范圍較廣，pH 4.0～9.0均可生長，但是隨著pH值的升高，烏芝菌絲長速先升后降，pH 8.0時菌絲長速達到最快，為5.25 mm/d，其后長速減緩。pH值低于6時，菌絲長速顯著降低。菌絲長勢與菌絲長勢一直，隨著pH值的升高，長勢趨好，pH 7.0～8.0時長勢最好，表明烏芝菌絲適宜在中性偏弱堿性環(huán)境下生長。綜上所述，該菌株喜適宜生長的pH范圍為7.0～8.0。

表3 不同pH值對BYWZ菌絲生長情況比較

2.7 不同溫度值對烏芝菌絲體生長的影響

不同溫度試驗結果（表4）表明，烏芝菌絲生長溫度范圍較廣，15～35℃條件下均能生長。培養(yǎng)溫度低于30℃時，菌絲長速隨溫度上升逐漸加快，且長勢趨好，30℃時菌絲長速最快，長勢最好，高于30℃時菌絲開始受到抑制，生長減慢，溫度達35℃時，幾乎不能生長，說明該菌株適宜生長溫度范圍為25～30℃。

表4 不同溫度對烏芝菌絲生長速度與長勢的影響

3 結論與討論

本研究通過形態(tài)學與ITS序列鑒定，確定了一株野生假芝的分類學位置，該野生菌株屬于靈芝科假芝屬真菌，與烏芝（Amauroderma rugosum，登陸號KJ654361.1）同源性最高。生物學特性分析試驗結果表明，該菌株菌絲生長最適碳源是果糖，其次是葡萄糖；最適氮源是麩皮，其次是豆粨粉；最適pH生長范圍是pH 7.0～8.0；最適生長溫度范圍是25～30℃。

目前，世界范圍內(nèi)對假芝屬馴化栽培的研究報道較少，僅少數(shù)真菌分類學者報道了其分類位置，采摘時間、地點等［15］。國內(nèi)一些學者對鄒蓋假芝菌絲液體深層發(fā)酵條件［16-19］及引種袋料栽培、富硒菌株篩選等做了一些報道［20-21］，栽培種也僅有文獻報道為臺灣引種［22］，國內(nèi)野生假芝資源仍然未被馴化利用。關于烏芝馴化栽培研究報道更是極少，其生物學特性、栽培特性、子實體營養(yǎng)成分分析等也不甚了解。本研究成功分離獲得烏芝純菌絲體，并首次對其生物學特性進行了研究，為烏芝的人工馴化栽培奠定基礎，下一步我們將開展烏芝馴化栽培及其子實體成分研究，為烏芝的開發(fā)利用提供參考。

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（責任編輯 楊賢智）

中圖分類號：S567.3+1

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）03-0072-05

收稿日期：2015-11-11

基金項目：廣東省科技廳協(xié)同創(chuàng)新與平臺環(huán)境建設項目（2014A070713009）；佛山市順德區(qū)產(chǎn)學研合作項目（2014CXY16）；廣東省農(nóng)科院院長基金（201607）；廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所所長基金（所-201504）

作者簡介：肖自添（1981-），女，碩士，助理研究員，E-mail：xzt2006@163.com

通訊作者：何煥清（1964-），男，研究員，E-mail：hhq407@sian.com

Research on identification and biological characteristics of a wild Amauroderma rugosum

XIAO Zi-tian，LIU Ming，HE Huan-qing
（Vegetables Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Guangdong Vegetables Newly Technology，Guangzhou 510640，China）

Abstract：We collected a wild Amauroderma mushroom from the Baiyun mountain，Guangzhou City，Guangdong Province. By morphology and ITS sequence analysis，it was confirmed that the strain belonged to the genus Amauroderma family，and had highly homology with Amauroderma rugosum，strain numbered as BYWZ. Culture conditions results showed that the best carbon source for the mycelial growth was fructose，the best nitrogen source was wheat bran，temperature was optimal at 30℃，and the optimal pH range was 7.0-8.0. It will be conducive to further artificial domestic cultivation of A. rugosum，and the application of wild mushroom resources in our country.

Key words：wild Amauroderma；identification；ITS sequence；domestication