丁彬彬,段正軍

(1.上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科　200083；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院肝病研究所，蘭州 730030)

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·論著·

應(yīng)用PCR-LDR法比較2個(gè)地區(qū)慢性乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型

丁彬彬1,段正軍2

(1.上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科200083；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院肝病研究所，蘭州 730030)

摘要:目的探討上海和蘭州2個(gè)地區(qū)的慢性乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型的比較及關(guān)系。方法取上海和蘭州地區(qū)慢性乙型肝炎患者194例和325例的血清，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-連接酶反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)(LDR)法對(duì)常見的7種耐藥突變位點(diǎn)和B型、C型兩種型別進(jìn)行檢測(cè)。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果(1)2個(gè)地區(qū)均以C型為主，上海、蘭州分別為79.3%、81.4%。(2)上海地區(qū)突變比率(48.9%)高于蘭州地區(qū)(35.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2個(gè)地區(qū)耐藥突變均以拉米夫定突變?yōu)橹鳎?5.7%(153/202，上海68/92，蘭州85/110)，2個(gè)地區(qū)導(dǎo)致拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而2個(gè)地區(qū)的阿德福韋耐藥位點(diǎn)均以rtA181T/V為主，地區(qū)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)是否耐藥突變與基因型無相關(guān)性，C基因中上海地區(qū)的突變比率(49.0%)高于蘭州地區(qū)(35.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)4種耐藥比率在與基因型無相關(guān)性。結(jié)論上海、蘭州2個(gè)地區(qū)在基因型分布上相似，上海地區(qū)發(fā)生耐藥比率更高，2個(gè)地區(qū)均顯示發(fā)生耐藥與否以及耐藥類型與基因無關(guān)。

關(guān)鍵詞:PCR-連接酶檢測(cè)反應(yīng)；乙型肝炎病毒；耐藥突變；基因型

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有3.5億人感染慢性乙型肝炎，超過100萬人死于肝硬化和肝癌[1]。乙型肝炎病毒(HBV)持續(xù)感染與肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。HBV根據(jù)基因組全序列的差異性是否大于8%分為A～H 8種基因型[3]。在中國(guó)，較為常見的是B型和C型，其中B型和C型,按照中國(guó)南北地域分布存在差，北方以C型為主，南方以B型為主，而A型和D型則較少發(fā)現(xiàn)[4-5]。一些研究表明不同基因型對(duì)抗病毒治療的藥物應(yīng)答不同，B型要比C型對(duì)干擾素的應(yīng)答好；另外，C型通常與HBV重度感染、肝硬化、肝癌更加高度相關(guān)[6-7]。目前，用于乙型肝炎治療常用的核苷類似物藥類存在耐藥突變，主要的突變位點(diǎn)有7個(gè)，分別為rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I/V、rtN236T、M205V[8]。準(zhǔn)確地對(duì)HBV進(jìn)行分型和耐藥位點(diǎn)突變檢測(cè)非常重要，對(duì)乙型肝炎患者的用藥、預(yù)后有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-連接酶反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)(LDR)是目前研究較多，靈敏度高、特異性強(qiáng)，且性價(jià)比高的檢測(cè)方法，可以用于臨床檢測(cè)基因分型和多耐藥位點(diǎn)檢測(cè)[8-10]。

對(duì)于HBV的分型和耐藥的研究以一個(gè)地區(qū)較多，而對(duì)2個(gè)地區(qū)比較的研究較少，尤其是對(duì)中國(guó)東西2個(gè)城市比較。本文對(duì)地理位置分別在東部和西北部的上海和蘭州進(jìn)行了分型和耐藥的比較研究。

1資料與方法

1.1一般資料本次研究所用的血清標(biāo)本收集于上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心和蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，共計(jì)519例，其中上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心194例(2013年1月至2015年10月)，男119例，女75例，年齡26～67歲，平均43.72歲；蘭州大學(xué)第二醫(yī)院325例(2013年8月至2015年5月)，男213例，女112例，年齡24～72歲，平均45.23歲；上述患者血清標(biāo)本采集均符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》中的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑儀器使用美國(guó)伯樂公司MJ-90 PCR 儀，ABI公司ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和美國(guó)ABI公司ABI3130 DNA測(cè)序儀。乙型肝炎DNA提取試劑為上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展公司(簡(jiǎn)稱上海星耀)乙型肝炎DNA磁珠提取試劑盒，乙型肝炎DNA定量檢測(cè)使用HBV核酸擴(kuò)增熒光定量試劑盒，耐藥位點(diǎn)擴(kuò)增、LDR反應(yīng)和測(cè)序使用上海星耀生產(chǎn)的HBV多耐藥基因位點(diǎn)分型試劑盒。

1.3方法

1.3.1血清乙型肝炎DNA提取按照上海星耀生產(chǎn)的DNA提取試劑盒進(jìn)行。

1.3.2PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、LDR反應(yīng)和毛細(xì)管電泳均按照上海星耀生產(chǎn)的HBV多耐藥基因位點(diǎn)分型試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理電泳結(jié)束后結(jié)果判定通過GeneMapper4.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 17.0進(jìn)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1特異性檢測(cè)、檢測(cè)下限和重復(fù)性隨機(jī)挑選經(jīng)LDR法檢測(cè)突變位點(diǎn)為rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T、M205V以及野生型各3例進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，LDR法檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序結(jié)果均一致。

按照試劑盒說明書的最低檢測(cè)下限103copies/mL，挑選含不同突變位點(diǎn)的rtL180M、rtA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T、M205V和野生型標(biāo)本1～3例，進(jìn)行乙型肝炎DNA不同病毒載量檢測(cè)，根據(jù)定量結(jié)果將這些標(biāo)本稀釋至103～104copies/mL，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，均能檢測(cè)出相應(yīng)突變。

本實(shí)驗(yàn)共測(cè)試519例標(biāo)本，19例標(biāo)本未檢測(cè)出，其中上海地區(qū)13例，蘭州地區(qū)6例。對(duì)19例標(biāo)本進(jìn)行DNA定量檢測(cè)結(jié)果低于試劑盒檢測(cè)下限，符合試劑盒性能。

2.2HBV基因型結(jié)果本次PCR-LDR法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行了B型和C型檢測(cè)，其他型別未進(jìn)行檢測(cè)。2個(gè)地區(qū)的B、C分型的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。500例測(cè)試標(biāo)本中C型為主，共403例(80.6%)，B型74例(14.8%)、非B非C18例(3.6%)，B/C混合型5例(1%)，同樣上海地區(qū)(79.3%，149/188)和蘭州地區(qū)(81.4%，254/312)的均以C型為主。2個(gè)地區(qū)間的B、C、非B非C型、B/C混合型所占比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.329)，排除非B非C型和B/C混合型不考慮，2個(gè)地區(qū)的B、C型分布之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.215)。

表1　2個(gè)地區(qū)HBV基因型及耐藥統(tǒng)計(jì)情況[n(%)]

注：耐藥突變統(tǒng)計(jì)按照發(fā)生拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、阿德福韋耐藥突變計(jì)算，若有相關(guān)位點(diǎn)突變但未導(dǎo)致耐藥突變未列為耐藥突變。

2.32個(gè)地區(qū)HBV耐藥突變結(jié)果本次500例標(biāo)本中共有208例標(biāo)本發(fā)生rtL180M、rtLA181T/V、rtT184G、rtS202I、rtM204、rtM204V、 rtM204I/V、 rtN236T、rtM250V當(dāng)中的某個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)突變，共檢測(cè)出32種突變位點(diǎn)組合，其中6例標(biāo)本未發(fā)生耐藥突變。耐藥突變比率為41.6%，其中上海地區(qū)為48.9%(92/188)，蘭州地區(qū)35.3%(110/312)，2個(gè)地區(qū)突變比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 5)。202例耐藥突變標(biāo)本中拉米夫定突變153例，占總耐藥突變比率的75.7%(上海68例，蘭州85例)；各種耐藥突變比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2個(gè)地區(qū)拉米夫定突變不同：上海地區(qū)rtM204I、rtM204V突變?yōu)橹?，其他形式突變少?shù)；而蘭州地區(qū)以rtM204V為主；對(duì)2個(gè)地區(qū)rtM204I、rtM204V進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007 5)。對(duì)阿德福韋耐藥的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行類似分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)均以rtA181T/V為主，地區(qū)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.994 0)。恩替卡韋的突變例數(shù)較少未進(jìn)行位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有突變標(biāo)本中，發(fā)生2種或2種以上耐藥突變共109例，占總耐藥突變比率的54.0%，其中上海46.7%(43/92)，蘭州60.0%(66/110)，2個(gè)地區(qū)多耐藥情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059 7)，發(fā)生3種藥物耐藥突變7例(上海3例，蘭州4例)，無4種藥物共同耐藥突變，其中2種耐藥以拉米夫定和替比夫定同時(shí)耐藥為主，占84.4%(92/109，上海33/43，蘭州59/66)。

2.4HBV基因型與耐藥突變關(guān)系對(duì)2個(gè)地區(qū)的BC分型及耐藥突變的分布統(tǒng)計(jì)見表1。由于B/C混合型和非B非C型在總數(shù)中所占比例較小，結(jié)果分析剔除了這些標(biāo)本。對(duì)所有耐藥突變按照B型和C型的進(jìn)行分類如下：B型39.2%(29/74)，C型40.4%(163/403)，B、C型耐藥突變比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.839)。對(duì)2個(gè)地區(qū)B、C型的突變比例分開進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到類似結(jié)果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中上海地區(qū)(P=0.956)、蘭州地區(qū)(P=0.642)。對(duì)B或C型突變?cè)谏虾：吞m州地區(qū)的所占比率分別進(jìn)行地區(qū)間比較：兩個(gè)地區(qū)間B型耐藥突變情況(上海48.5%，蘭州31.7%)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.14)，2個(gè)地區(qū)間C型耐藥突變(上海49.0%，蘭州35.3%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007 4)。

2.5耐藥突變與HBV基因型比較對(duì)發(fā)生耐藥突變的標(biāo)本按4種藥物類型與基因型進(jìn)行分類見表2，所有B和C型中4種耐藥突比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.68)，對(duì)上海地區(qū)和蘭州地區(qū)單獨(dú)進(jìn)行分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)耐藥突變位點(diǎn)的基因分析，發(fā)現(xiàn)rtL180M絕大分發(fā)生在C型中(34,1B33C)，2個(gè)地區(qū)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其他幾個(gè)位點(diǎn)基因型的分析見表3。關(guān)于耐藥位點(diǎn)的與基因分型關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了一些位點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如 rtL180M、rtT184G、rtM250V；但同時(shí)也有位點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，如rtLA181T/V、rtS202I、rtM204I、rtM204V、rtN236T。

表2　2個(gè)地區(qū)的耐藥類型與基因型統(tǒng)計(jì)比較[n(%)]

表3　2個(gè)地區(qū)的突變位點(diǎn)與基因型統(tǒng)計(jì)比較(n)

3討論

3.1PCR-LDR法性能分析PCR-LDR法是利用PCR法首先對(duì)目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行LDR反應(yīng)即連接酶反應(yīng)。LDR的原理是利用具有極強(qiáng)的突變識(shí)別能力的連接酶，當(dāng)上下游探針跟目標(biāo)產(chǎn)物雜交時(shí)，探針和目標(biāo)完全互補(bǔ)才能進(jìn)行連接酶反應(yīng)，如果上下游引物發(fā)生錯(cuò)配則連接反應(yīng)不能進(jìn)行；對(duì)于PCR-LDR法的性能相關(guān)研究已有數(shù)據(jù)顯示：該方法在檢測(cè)乙型肝炎的耐藥型和基因型具有PCR高靈敏度、高特異性和測(cè)序法的高精準(zhǔn)度特點(diǎn)，且相對(duì)測(cè)序法性價(jià)比更高[8-10]。本文沒有過多對(duì)這些性能進(jìn)行大數(shù)據(jù)驗(yàn)證，就章節(jié)2.1中涉及的驗(yàn)證均與先前研究符合[8-10]，表明該檢測(cè)方法的可靠性。

3.22個(gè)地區(qū)乙型肝炎型別的關(guān)系由于中國(guó)地區(qū)主要乙型肝炎型別為B型和C型，本試劑盒只對(duì)B型和C型進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)和蘭州地區(qū)的基因型均以C型為主，本研究中2個(gè)地區(qū)的各基因分布情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，蘭州地區(qū)略高于上海地區(qū)，這些結(jié)果符合先前研究，北方地區(qū)以C型為主[3-5]，上海地區(qū)的C型比先前的研究要略高[11]，這可能與標(biāo)本基數(shù)不夠大和上海地區(qū)流動(dòng)人口比較多有關(guān)系。值得一提的是，本文研究中檢測(cè)出的非B非C型主要集中在蘭州地區(qū)，可能與該地區(qū)的少數(shù)民族的比率高于上海地區(qū)有關(guān)系，對(duì)于HBV的基因分型的研究也顯示中國(guó)地區(qū)的A型和D型主要存在于少數(shù)民族[5]。

3.3耐藥位點(diǎn)突變分析本文耐藥位點(diǎn)突變的判讀基于先前的已有研究[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在所有208例發(fā)生位點(diǎn)突變患者中，有6例沒有產(chǎn)生耐藥，這可能在服用核苷類似物之前發(fā)生先天性的突變，但具體突變機(jī)理需要進(jìn)一步研究。對(duì)2個(gè)地區(qū)耐藥突變情況進(jìn)行比較，2個(gè)地區(qū)的發(fā)生耐藥突變的比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這可能與2個(gè)地區(qū)的經(jīng)濟(jì)水平有關(guān)，上海地區(qū)的患者可能接受治療概率比蘭州地區(qū)高，由于沒有患者的詳細(xì)診療資料，具體原因需要進(jìn)一步探究。研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)地區(qū)均以拉米夫定突變?yōu)橹鳎@與拉米夫定突變的單位點(diǎn)突變相關(guān)， rtM204I/V或rtL180M某一位點(diǎn)發(fā)生突變便產(chǎn)生耐藥。恩替卡韋的耐藥突變率最低，這與其耐藥為多位點(diǎn)突變有關(guān)系，其中恩替卡韋的6例突變5例存在于上海地區(qū)，也側(cè)面說明上海地區(qū)患者可能接受治療的比率更高，且更改過治療方案。2個(gè)地區(qū)的多耐藥情況，均以拉米夫定和替比夫定為主，這與替比夫定與拉米夫定的其中一個(gè)耐藥位點(diǎn)相同相關(guān)。

3.4是否耐藥突變與基因型關(guān)系分析對(duì)于2個(gè)地區(qū)的BC分型和是否耐藥突變分析，未發(fā)現(xiàn)是否耐藥突變?cè)?種基因的存在偏好性。本研究顯示與先前部分的研究結(jié)果相似，突變與否與基因型無關(guān)[12-14]，本研究也與部分研究結(jié)果有所出入，這些研究認(rèn)為C型較B型更容易發(fā)生耐藥突變[14-15]。對(duì)2個(gè)地區(qū)的B型和C型的耐藥與否進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，C型中上海地區(qū)發(fā)生耐藥比率明顯高于蘭州地區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，就此結(jié)果未找到相關(guān)文獻(xiàn)，是偶然性還是其他因素，有待進(jìn)一步研究。

3.5耐藥突變位點(diǎn)及耐藥藥物種類與HBV基因型分析通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)果同3.4，耐藥的藥物種類與HBV基因型無相關(guān)性，從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看未發(fā)現(xiàn)某種藥物耐藥突變傾向于某種基因型，這與先前研究基本一致[12-13]。值得一提是，6例發(fā)生恩替卡韋突變標(biāo)本均為C型，這一現(xiàn)象可以作為進(jìn)一步研究對(duì)象。對(duì)于耐藥突變位點(diǎn)與基因型的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn)部分位點(diǎn)與基因型有關(guān)，如rtL180M、rtT184G、rtM250V更偏好C型，但由于實(shí)驗(yàn)基數(shù)不大的原因，這一結(jié)論需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

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作者簡(jiǎn)介：丁彬彬，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床免疫與生化研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.026

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)13-1814-04

(收稿日期：2016-01-29修回日期：2016-04-10)

Comparative research on nucleoside drug resistance mutation and genotypes of chronic hepatitis B virus in two areas by PCR-LDR method

DINGBinbin1,DUANZhengjun2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HongkouDistrictMentalHealthCenter,Shanghai200083,China;2.ResearchInstituteofLiverDisease,SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China)

Abstract:ObjectiveTo perform a comparative research on nucleoside drug resistance mutation and genotypes of chronic hepatits B virus in Shanghai and Lanzhou.MethodsThe serum samples(Shanghai,194 cases) and (Lanzhou,325 cases) were collected.The common 7 drug resistant mutation loci,genotype B and C were detected by using the PCR-LDR method.The obtained data were analyzed by using the SPSS17.0 statistical software.Results(1) Genotype C was the main genotype in two areas (Shanghai 79.3%,Lanzhou 81.4%).(2) The mutation rate in Shanghai was higher than that in Lanzhou with statistical difference (48.9% vs.35.3%,P<0.01).Lamivudine resistance mutation was predominant in all the mutations of two areas，accounting for 75.7% (153/202;Shanghai 68/92,Lanzhou 85/110);the difference in lamivudine resisrtance mutation loci had statistical difference between the two areas;while the adefovir resistance loci was dominated by rtA181T/V,the area difference had no statistical significance(P>0.05).(3) The drug resistance mutation had no correlation with genotype.The C genotype mutation rate in Shanghai was higher than that in Lanzhou,the difference was statistically significant(49.0% vs.35.4%,P<0.05 ).(4) 4 kinds of drug resistance rate had no correlation with genotype.ConclusionThe genotype distributions are similar in two areas;Shanghai has a higher drug resistance rate than Lanzhou;the drug resistance occurrence has no relation with drug resistance type and genotype.

Key words:PCR-LDR;HBV;drug resistance;genotype