譚敏秀，何錦鈞，關(guān)杏英，周　清，任燕芬

(1.佛山市中醫(yī)院，佛山　528000；2.廣東藥學(xué)院，廣州　510006)

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RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素的含量

譚敏秀1，何錦鈞1，關(guān)杏英1，周清2*，任燕芬1

(1.佛山市中醫(yī)院，佛山528000；2.廣東藥學(xué)院，廣州510006)

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素含量的方法。方法采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脫)；流速為0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm；柱溫約為20 ℃。結(jié)果阿魏酸和姜黃素質(zhì)量濃度分別在7～148和20～200 μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為108.4%和103.7%,RSD值分別為1.9%和1.2%。樣品中阿魏酸和姜黃素平均含量分別為0.4和1.27 mg·g-1。結(jié)論該方法精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：天黃顆粒；阿魏酸；姜黃素；反相高效液相色譜法；含量測(cè)定

天黃顆粒是醫(yī)院在制劑天柏金黃散基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的顆粒劑型外用藥，由黃柏、姜黃、當(dāng)歸和大黃等多味藥材制成，具有涼血、活血、化瘀、止痛的功效。在處方中，當(dāng)歸味辛，有活血化瘀、去腫止痛的作用；姜黃味辛，泄苦通溫，為血中氣藥，古今醫(yī)家視之為風(fēng)濕肩臂疼痛的要藥。為了更好地控制制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以該方中主要有效成分阿魏酸和姜黃素為指標(biāo)，擬建立1種簡(jiǎn)便可靠的含量測(cè)定方法。經(jīng)查閱，同時(shí)對(duì)天黃顆粒中阿魏酸[1-6]和姜黃素[7-11]進(jìn)行含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本方法分離效果好，定量準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性較強(qiáng)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(LC-10ATvp plus，UV檢測(cè)器，日本島津公司)；LC Solution色譜工作站。

1.2試藥對(duì)照品：阿魏酸(批號(hào)0773-9910)、姜黃素(批號(hào)110823-200603)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；天黃顆粒(批號(hào)141101-141103)，由佛山市中醫(yī)院提供。甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

2方法與結(jié)果

2.1樣品液制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品14.8 mg、姜黃素對(duì)照品20.0 mg，分別置于100 mL量瓶中，加700 mL· L-1甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為148和200 μg·mL1的阿魏酸和姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2供試品溶液的制備稱取2 g天黃顆粒，加入700 mL· L-1的甲醇30 mL，加熱回流處理30 min，濾過(guò)，收集濾液，再用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，得供試品溶液。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備按照處方組成，取除當(dāng)歸、姜黃外的其余藥味，按照工藝要求制成不含當(dāng)歸和姜黃的天黃顆粒；按照2.1.2項(xiàng)下操作方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)為色譜柱；乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1)為流動(dòng)相；流速為0.8 mL·min1；檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm；柱溫為室溫(約20 ℃)。分別取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定；以阿魏酸或姜黃素計(jì)算理論板數(shù)均不低于5 000；阿魏酸和姜黃素峰的拖尾因子分別為0.91和0.97；保留時(shí)間分別約為15.7和31.1 min；與相鄰未知峰的分離度均大于1.5；陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品； B.樣品；C.陰性；1.阿魏酸；2.姜黃素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative；1.ferulic acid；2.curcumin

表1流動(dòng)相梯度洗脫程序

Tab.1 The gradient elution programs of mobile phase

時(shí)間/min乙腈/%1mL·L-1磷酸/%0～15 20→50 80→5015～30 50→100 50→0>301000

2.3方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下的阿魏酸和姜黃素儲(chǔ)備液，加700 mL·L-1的甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的阿魏酸(質(zhì)量濃度分別為7，14，21，28，35，70和148 μg·mL1)、姜黃素(質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80，120，160和200 μg·mL1)溶液，依次進(jìn)樣(進(jìn)樣量20 μL)。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積均值為縱坐標(biāo)，繪制阿魏酸和姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。得阿魏酸的回歸方程Y=43 181X+20 201(r=0.999 4)，姜黃素的回歸方程Y=35 416X-161 847(r=0.999 3)。表明阿魏酸質(zhì)量濃度在7～148μg·mL1之間、姜黃素質(zhì)量濃度在20～200 μg·mL1之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)取質(zhì)量濃度為21 μg·mL1的阿魏酸和80 μg·mL1的姜黃素對(duì)照品混合溶液連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。阿魏酸和姜黃素峰面積的RSD值分別為0.41%和0.33%，表明儀器的精密度良好。2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)141101)，分別在0，2，4，6，8和12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，阿魏酸和姜黃素峰面積的RSD值分別為0.71%和0.41%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)141101)6份，按照2.1和2.2項(xiàng)下所述方法處理、測(cè)定，結(jié)果阿魏酸平均質(zhì)量濃度為27.32 mg·mL1、姜黃素平均質(zhì)量濃度為84.71 mg·mL1，RSD值分別為0.98%和0.41%，表明分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收實(shí)驗(yàn)稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)141101)9份，每份2 g，按照2.1項(xiàng)下所述方法處理，取適量已知含量的供試品，每3份中分別加入約80%，100%和120%的阿魏酸和姜黃素混合對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，見(jiàn)表2，阿魏酸的平均回收率為108.4%，RSD值為1.9%；姜黃素的平均回收率為103.7%，RSD值為1.2%。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠。

表2回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the recovery test

阿魏酸樣品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均檢出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)姜黃素樣品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均檢出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)27.3222.5051.19108.41.984.7167.50153.86103.71.227.3227.5056.7284.7185.00172.1027.3235.0065.9284.71100.00190.06

2.4樣品測(cè)定取天黃顆粒樣品3批，按照2.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得出樣品中阿魏酸和姜黃素的平均含量分別為0.40和1.27 mg·g-1。

3討論

阿魏酸易溶于熱水、乙醇和乙酸乙酯，稍溶于乙醚，難溶于苯和石油醚；因此常采用醇-水混合溶劑提取，提取方式常采用回流、超聲等；姜黃素不溶于水，溶于醇類(lèi)溶劑。因此在提取分離條件的摸索過(guò)程中，采用醇-水混合溶劑提取，比較了超聲和回流2種不同的提取方式，并比較了提取時(shí)間、溶劑量和溶劑比率對(duì)提取率的影響。結(jié)果表明，15倍(質(zhì)量比)的混合溶劑(體積分?jǐn)?shù)70%甲醇-水)回流提取30 min，離心，過(guò)濾后制得的樣品溶液，阿魏酸和姜黃素的提取率均較高。

阿魏酸具有一定的弱酸性，且出峰時(shí)間較短，存在峰形拖尾的現(xiàn)象，因此在流動(dòng)相中加酸后色譜峰峰形明顯改善，分離度也大大提高。文獻(xiàn)報(bào)道[2-6],阿魏酸含量測(cè)定流動(dòng)相體系較多，如乙腈-磷酸水、甲醇-醋酸水、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇等，本文也選用了這幾種流動(dòng)相分別進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)選用乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液(梯度洗脫)為流動(dòng)相效果最好，故采用了表1的流動(dòng)相體系及梯度變換方式。

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基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(編號(hào):B2014212)；2014年佛山市醫(yī)學(xué)類(lèi)科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):2014AB00341)

作者簡(jiǎn)介：譚敏秀，女，副主任藥師

*通信作者：周清，男，講師

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.014

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0374-03

(收稿日期：2015-09-15)

Simultaneous determination of ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules by RP-HPLC

TAN Minxiu1，HE Jinjun1，GUAN Xingying1，ZHOU Qing2*，REN Yanfen1

(1.Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)oshan 528000，China；2.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

Abstract:Objective To establish a determination method for ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules.Methods An RP-HPLC method was established.The chromatographic column was Diamond-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was a mixture of acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (gradient elution).The flow rate was 0.8 mL·min-1,the UV detection wavelength was 354 nm，and the column temperature was 20 ℃.Results The linear range of ferulic acid was between 7-148 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 108.4%，RSD was 1.9%.The linear range of curcumin was between 20-200 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 103.7%，RSD was 1.2%. The average contents of ferulic acid and curcumin were 0.4 and 1.27 mg·g-1,respectively.Conclusion The method is accurate with high precision， and can be used for the quantitative determination of Tianhuang Granules.

Key words：Tianhuang Ganules；ferulic acid；curcumin；RP-HPLC；assay