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        RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素的含量

        2016-07-27 07:06:17譚敏秀何錦鈞關(guān)杏英任燕芬
        西北藥學(xué)雜志 2016年4期
        關(guān)鍵詞:阿魏酸姜黃素含量測(cè)定

        譚敏秀,何錦鈞,關(guān)杏英,周 清,任燕芬

        (1.佛山市中醫(yī)院,佛山 528000;2.廣東藥學(xué)院,廣州 510006)

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        RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素的含量

        譚敏秀1,何錦鈞1,關(guān)杏英1,周清2*,任燕芬1

        (1.佛山市中醫(yī)院,佛山528000;2.廣東藥學(xué)院,廣州510006)

        摘要:目的建立同時(shí)測(cè)定天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素含量的方法。方法采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脫);流速為0.8 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm;柱溫約為20 ℃。結(jié)果阿魏酸和姜黃素質(zhì)量濃度分別在7~148和20~200 μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積線性關(guān)系良好,平均回收率分別為108.4%和103.7%,RSD值分別為1.9%和1.2%。樣品中阿魏酸和姜黃素平均含量分別為0.4和1.27 mg·g-1。結(jié)論該方法精密度好,結(jié)果準(zhǔn)確,可用于天黃顆粒中阿魏酸和姜黃素的含量測(cè)定。

        關(guān)鍵詞:天黃顆粒;阿魏酸;姜黃素;反相高效液相色譜法;含量測(cè)定

        天黃顆粒是醫(yī)院在制劑天柏金黃散基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的顆粒劑型外用藥,由黃柏、姜黃、當(dāng)歸和大黃等多味藥材制成,具有涼血、活血、化瘀、止痛的功效。在處方中,當(dāng)歸味辛,有活血化瘀、去腫止痛的作用;姜黃味辛,泄苦通溫,為血中氣藥,古今醫(yī)家視之為風(fēng)濕肩臂疼痛的要藥。為了更好地控制制劑的質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)以該方中主要有效成分阿魏酸和姜黃素為指標(biāo),擬建立1種簡(jiǎn)便可靠的含量測(cè)定方法。經(jīng)查閱,同時(shí)對(duì)天黃顆粒中阿魏酸[1-6]和姜黃素[7-11]進(jìn)行含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,本方法分離效果好,定量準(zhǔn)確,專(zhuān)屬性較強(qiáng)。

        1儀器與試藥

        1.1儀器高效液相色譜儀(LC-10ATvp plus,UV檢測(cè)器,日本島津公司);LC Solution色譜工作站。

        1.2試藥對(duì)照品:阿魏酸(批號(hào)0773-9910)、姜黃素(批號(hào)110823-200603),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院;天黃顆粒(批號(hào)141101-141103),由佛山市中醫(yī)院提供。甲醇、乙腈均為色譜純;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

        2方法與結(jié)果

        2.1樣品液制備

        2.1.1對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品14.8 mg、姜黃素對(duì)照品20.0 mg,分別置于100 mL量瓶中,加700 mL· L-1甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度分別為148和200 μg·mL1的阿魏酸和姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

        2.1.2供試品溶液的制備稱取2 g天黃顆粒,加入700 mL· L-1的甲醇30 mL,加熱回流處理30 min,濾過(guò),收集濾液,再用0.45 μm的濾膜過(guò)濾,得供試品溶液。

        2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備按照處方組成,取除當(dāng)歸、姜黃外的其余藥味,按照工藝要求制成不含當(dāng)歸和姜黃的天黃顆粒;按照2.1.2項(xiàng)下操作方法制成陰性對(duì)照溶液。

        2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)Diamond-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,迪馬公司)為色譜柱;乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液(二元梯度洗脫,洗脫程序見(jiàn)表1)為流動(dòng)相;流速為0.8 mL·min1;檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm;柱溫為室溫(約20 ℃)。分別取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀,依法測(cè)定;以阿魏酸或姜黃素計(jì)算理論板數(shù)均不低于5 000;阿魏酸和姜黃素峰的拖尾因子分別為0.91和0.97;保留時(shí)間分別約為15.7和31.1 min;與相鄰未知峰的分離度均大于1.5;陰性對(duì)照無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

        圖1HPLC圖

        A.對(duì)照品; B.樣品;C.陰性;1.阿魏酸;2.姜黃素

        Fig.1 HPLC chromatograms

        A.reference substance;B.sample;C.negative;1.ferulic acid;2.curcumin

        表1流動(dòng)相梯度洗脫程序

        Tab.1 The gradient elution programs of mobile phase

        時(shí)間/min乙腈/%1mL·L-1磷酸/%0~15 20→50 80→5015~30 50→100 50→0>301000

        2.3方法學(xué)考察

        2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下的阿魏酸和姜黃素儲(chǔ)備液,加700 mL·L-1的甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的阿魏酸(質(zhì)量濃度分別為7,14,21,28,35,70和148 μg·mL1)、姜黃素(質(zhì)量濃度分別為20,40,60,80,120,160和200 μg·mL1)溶液,依次進(jìn)樣(進(jìn)樣量20 μL)。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積均值為縱坐標(biāo),繪制阿魏酸和姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。得阿魏酸的回歸方程Y=43 181X+20 201(r=0.999 4),姜黃素的回歸方程Y=35 416X-161 847(r=0.999 3)。表明阿魏酸質(zhì)量濃度在7~148μg·mL1之間、姜黃素質(zhì)量濃度在20~200 μg·mL1之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

        2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)取質(zhì)量濃度為21 μg·mL1的阿魏酸和80 μg·mL1的姜黃素對(duì)照品混合溶液連續(xù)測(cè)定6次,記錄峰面積。阿魏酸和姜黃素峰面積的RSD值分別為0.41%和0.33%,表明儀器的精密度良好。2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)141101),分別在0,2,4,6,8和12 h進(jìn)樣,記錄峰面積,阿魏酸和姜黃素峰面積的RSD值分別為0.71%和0.41%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)141101)6份,按照2.1和2.2項(xiàng)下所述方法處理、測(cè)定,結(jié)果阿魏酸平均質(zhì)量濃度為27.32 mg·mL1、姜黃素平均質(zhì)量濃度為84.71 mg·mL1,RSD值分別為0.98%和0.41%,表明分析方法的重復(fù)性良好。

        2.3.5加樣回收實(shí)驗(yàn)稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)141101)9份,每份2 g,按照2.1項(xiàng)下所述方法處理,取適量已知含量的供試品,每3份中分別加入約80%,100%和120%的阿魏酸和姜黃素混合對(duì)照品溶液,按照2.2項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算回收率,見(jiàn)表2,阿魏酸的平均回收率為108.4%,RSD值為1.9%;姜黃素的平均回收率為103.7%,RSD值為1.2%。結(jié)果表明,本方法準(zhǔn)確可靠。

        表2回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        Tab.2 Results of the recovery test

        阿魏酸樣品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均檢出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)姜黃素樣品含量/μg·mL-1加入量/μg·mL-1平均檢出量(n=3)/μg·mL-1平均回收率/%(n=9)RSD/%(n=9)27.3222.5051.19108.41.984.7167.50153.86103.71.227.3227.5056.7284.7185.00172.1027.3235.0065.9284.71100.00190.06

        2.4樣品測(cè)定取天黃顆粒樣品3批,按照2.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液,按照2.2項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算得出樣品中阿魏酸和姜黃素的平均含量分別為0.40和1.27 mg·g-1。

        3討論

        阿魏酸易溶于熱水、乙醇和乙酸乙酯,稍溶于乙醚,難溶于苯和石油醚;因此常采用醇-水混合溶劑提取,提取方式常采用回流、超聲等;姜黃素不溶于水,溶于醇類(lèi)溶劑。因此在提取分離條件的摸索過(guò)程中,采用醇-水混合溶劑提取,比較了超聲和回流2種不同的提取方式,并比較了提取時(shí)間、溶劑量和溶劑比率對(duì)提取率的影響。結(jié)果表明,15倍(質(zhì)量比)的混合溶劑(體積分?jǐn)?shù)70%甲醇-水)回流提取30 min,離心,過(guò)濾后制得的樣品溶液,阿魏酸和姜黃素的提取率均較高。

        阿魏酸具有一定的弱酸性,且出峰時(shí)間較短,存在峰形拖尾的現(xiàn)象,因此在流動(dòng)相中加酸后色譜峰峰形明顯改善,分離度也大大提高。文獻(xiàn)報(bào)道[2-6],阿魏酸含量測(cè)定流動(dòng)相體系較多,如乙腈-磷酸水、甲醇-醋酸水、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲醇等,本文也選用了這幾種流動(dòng)相分別進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)選用乙腈-1mL·L-1磷酸水溶液(梯度洗脫)為流動(dòng)相效果最好,故采用了表1的流動(dòng)相體系及梯度變換方式。

        參考文獻(xiàn):

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        基金項(xiàng)目:廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(編號(hào):B2014212);2014年佛山市醫(yī)學(xué)類(lèi)科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào):2014AB00341)

        作者簡(jiǎn)介:譚敏秀,女,副主任藥師

        *通信作者:周清,男,講師

        doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.014

        中圖分類(lèi)號(hào):R927.2

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號(hào):1004-2407(2016)04-0374-03

        (收稿日期:2015-09-15)

        Simultaneous determination of ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules by RP-HPLC

        TAN Minxiu1,HE Jinjun1,GUAN Xingying1,ZHOU Qing2*,REN Yanfen1

        (1.Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine,F(xiàn)oshan 528000,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

        Abstract:Objective To establish a determination method for ferulic acid and curcumin in Tianhuang Granules.Methods An RP-HPLC method was established.The chromatographic column was Diamond-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was a mixture of acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (gradient elution).The flow rate was 0.8 mL·min-1,the UV detection wavelength was 354 nm,and the column temperature was 20 ℃.Results The linear range of ferulic acid was between 7-148 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 108.4%,RSD was 1.9%.The linear range of curcumin was between 20-200 μg·mL-1with a good linear relationship and the average recovery was 103.7%,RSD was 1.2%. The average contents of ferulic acid and curcumin were 0.4 and 1.27 mg·g-1,respectively.Conclusion The method is accurate with high precision, and can be used for the quantitative determination of Tianhuang Granules.

        Key words:Tianhuang Ganules;ferulic acid;curcumin;RP-HPLC;assay

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