梁靜，張淵2，曹靈3，孟祥龍，王莉2*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腎臟科，成都 610110；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟科，成都 610072；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000）

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纖溶系統(tǒng)對膜性腎病大鼠足細胞損傷的影響

梁靜1，張淵2，曹靈3，孟祥龍1，王莉2*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腎臟科，成都 610110；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟科，成都 610072；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000）

【摘要】目的 探討早期預(yù)防纖溶紊亂對防止MN進展有重要意義。方法 按改良Border法制作MN大鼠模型，正式免疫第1、2、3、4周末檢測全血uPA、tPA及PAI-1的表達水平；取大鼠腎組織進行光鏡、電鏡觀察腎組織病理學(xué)改變；采用免疫組化方法檢測腎足細胞nephrin、WTl蛋白表達含量，并進行相關(guān)性分析。結(jié)果 與正常組及干預(yù)組大鼠相比，模型組大鼠的全血uPA、tPA水平明顯減少，而PAI-1水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；電鏡顯示腎小球足細胞廣泛足突融合至消失；GBM基質(zhì)出現(xiàn)“釘樣突起”，腎間質(zhì)纖維化程度較重。腎小球足細胞分布區(qū)WT-1和nephrin蛋白表達下調(diào)，其中nephrin蛋白表達量變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，大鼠全血tPA和uPA水平與腎組織nephrin蛋白的表達變化呈正相關(guān)，全血PAI-1水平與腎組織nephrin蛋白的表達變化呈現(xiàn)負相關(guān)。結(jié)論 在MN發(fā)展中，纖溶系統(tǒng)對足細胞損傷凋亡具有重要意義，早期評估預(yù)測MN足細胞損傷情況或可為防治早期MN步入終末期腎臟病找到又一治療靶點，亦可為臨床研究治療MN的藥物提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】膜性腎病；足細胞；Nephrin；WT-1；纖溶系統(tǒng)

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種非炎癥性腎小球疾病，表現(xiàn)為腎小球細胞外基質(zhì)合成與降解失衡而導(dǎo)致的腎小球基底膜普遍增厚及腎小球硬化。纖溶系統(tǒng)在膜性腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［1］。作為纖溶系統(tǒng)中重要的活性物質(zhì)，血漿中組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）及其抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）之間的動態(tài)平衡，尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）等物質(zhì)對維持微血管的正常生理功能起重要作用［2］。本研究通過構(gòu)建大鼠膜性腎病模型，對膜性腎病血清uPA、tPA、PAI-1的變化情況及其對足細胞損傷凋亡的影響及腎臟病理的影響進行了探討，旨在為臨床預(yù)測MN足細胞損傷及預(yù)后提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

兔抗大鼠nephrin抗體、兔抗大鼠WT1多克隆抗體均購自Santa Cruz公司；陽離子化牛血清蛋白（C-BSA）購自Chondrex公司；低分子肝素速碧林購自杭州寒諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司；大鼠uPA ELISA試劑盒購自Elabscience公司；大鼠tPA ELISA試劑盒購自 Elabscience公司；大鼠 PAI-1 ELISA試劑盒購自Elabscience公司。

1.1.2 動物及分組

由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供雄性、清潔級SD大鼠30只，體重為（200±20）g，動物適應(yīng)環(huán)境7 d，將尿蛋白為陰性者隨機分為正常組和模型組，正常組10只；模型組10只；干預(yù)組10只。

1.2 方法

1.2.1 C-BSA腎炎模型制作

采用改良版Border法［3］，取C-BSA 1mL溶解于0.5 mL生理鹽水中，與等量不完全弗氏佐劑充分乳化，在大鼠頸背部，腹股溝等皮下多點注射，1周后通過連續(xù)4周隔日尾靜脈注射C-BSA（16 mg/kg）制作大鼠膜性腎病模型作為模型組，正常組隔日尾靜脈注射1 mL生理鹽水（NS）代替C-BSA。干預(yù)組參照說明書及相關(guān)文獻［3］每日分兩次皮下注射給予低分子肝素治療，確定劑量為450 U/kg。模型組及正常對照組每日兩次皮下注射給予同等劑量的生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本收集

各組大鼠于實驗第1、2、3、4周末各取4只用頸動脈托管法取血各6 mL后4℃離心分離血清，-20℃冰箱保存以供測定血清uPa、tPa、PAI-1；第4周末對各組大鼠殺檢，腎臟取下后剝離腎包膜，取一部分腎組織迅速置于液氮，之后轉(zhuǎn)入-80℃保存；其余腎組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟制成3 μm切片備用。

1.2.3 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)

取部分腎臟石蠟切片，分別進行PASM染色、Masson染色［4］，高倍光鏡及電鏡下觀察大鼠腎組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 腎臟組織病理學(xué)圖像分析

使用Meta Morph圖像分析系統(tǒng)在400倍光鏡下隨機選取10個視野測定每組PASM染色切片的腎小球系膜陽性目標(biāo)吸光度（A）。使用 HMIAS-2000高清晰彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在400倍光鏡下選取10個皮質(zhì)視野進行拍照，取平均值計算纖維化面積占整個視野間質(zhì)面積（腎小球、腎小管及血管面積不計算在內(nèi)）的比值。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢查

采用SP法，石蠟包埋的切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，體積分數(shù)為3%的H2O2阻斷清除內(nèi)源性過氧化物酶；正常山羊血清封閉液30℃恒溫封閉30 min，分別用抗體效價為1∶100 μL的兔抗大鼠nephrin、WT1多克隆抗體，4℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記的抗兔抗體（原液），30℃孵育40 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（原液），30℃孵育40 min；最后加DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以腎實質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)棕褐色顆粒為陽性，采用GD-8病理彩色圖像分析處理系統(tǒng)進行分析。

1.2.6 ELISA

血清uPa、tPa、PAI-1的檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 for Windows軟件包統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。相關(guān)性分析采用線性分析法。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)變化

與正常組相比，模型組血清uPa和tPa水平明顯下降，PAI-1顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間比較，模型組血清uPa從第1周開始顯著低于正常組，血清tPa水平從第2周開始顯著低于正常組，血清PAI-1從第2周開始顯著高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝素干預(yù)組一般指標(biāo)與正常組相似，從第二周開始，模型組較干預(yù)組各指標(biāo)差異有顯著性（P＜0.05）。見表1。

2.2 模型組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下可見正常組腎組織病理學(xué)檢測未見異常；干預(yù)組大鼠腎組織病理學(xué)檢測亦未見明顯異常；模型組HE染色可見腎小球明顯腫大，部分腎小管上皮細胞腫脹，腎間質(zhì)纖維化程度嚴重；Masson染色結(jié)果顯示嗜復(fù)紅蛋白有明顯沉積；PASM染色顯示GBM、TBM顯示彌漫性增厚，出現(xiàn)“梯狀”外觀。電鏡觀察顯示正常組腎組織超微結(jié)構(gòu)正常；模型組腎組織出現(xiàn)明顯病理損害，腎小球上皮下可見電子致密物沉積，“釘突”明顯可見，腎小球足細胞廣泛足突融合甚至消失。見圖1、2。

表1 各組大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比較（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

表1 各組大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比較（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

注：*與正常組相比，P＜0.05；#與干預(yù)組相比，P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

指標(biāo)Indexes干預(yù)組Intervention group uPa　1　1.13±0.06　0.86±0.04*　1.05±0.03 2 1.14±0.08　0.71±0.03*#　1.06±0.04 3 1.07±0.02　0.62±0.01*#　1.01±0.06 4 1.03±0.05　0.55±0.01*#　0.92±0.12 tPa　1　2.87±0.12　2.58±0.09　2.83±0.21 2 2.67±0.11　2.36±0.04*#　2.62±0.09 3 2.91±0.07　1.92±0.07*#　2.81±0.13 4 2.83±0.16　1.70±0.08*#　2.61±0.06 PAI-1　1　21.85±2.14　22.69±1.53　21.87±3.13 2 20.64±1.46　23.24±1.08*#　20.94±1.47 3 20.69±1.38　26.51±1.14*#　21.74±1.95 4 22.47±0.42　29.62±1.95*#　22.83±0.85 周Weeks正常組Normal group模型組Model group

2.3 大鼠腎間質(zhì)纖維化面積

模型組腎組織的纖維化面積為（28.21± 11.53）%，正常組為（12.63±5.42）%，干預(yù)組為（13.12±3.51）%；與正常組相比，模型組面積更大，差異有顯著性（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，大鼠全血tPA和uPA水平與腎間質(zhì)纖維化面積呈現(xiàn)負相關(guān)（r=-0.8654，P＜0.05；r=-0.8243，P ＜0.05），全血PAI-1水平與腎間質(zhì)纖維化面積呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.8324，P＜0.05）。

圖1 大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化×400；HE染色Fig.1 Pathological changes in the rat kidney tissues HE staining×400

注：從左到右依次為Masson染色（×400）、PASM染色（×400）、電鏡（×20 000）。圖2腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察Note.Pathological changes of the rat kidneys.Masson staining，×400；PASM staining，×400；Electron microscopy，×20 000.Fig.2 Pathological observation of the kidney tissues

2.4 腎組織WT1蛋白和nephrin蛋白的表達變化

正常組腎組織切片中可見nephrin呈淺棕色染色沿腎小球毛細血管襻呈均勻、線狀分布，腎小管有少量分布；干預(yù)組亦未見明顯異常；模型組4周時nephrin表達較正常組顯著減少，表達不均，稀疏，部分區(qū)域表達消失，較正常組及模型組差異有顯著性（P＜0.01），WT1于MN4周末時在足細胞核的表達呈深棕色粗大顆粒，與正常組及干預(yù)組比較差異無顯著性（P＞0.05）（見表2、圖3）。

2.5 腎組織Nephrin蛋白、WT1蛋白與全血tPA、uPA、PAI-1相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，模型組大鼠全血tPA和uPA水平與腎組織Nephrin蛋白的表達變化呈正相關(guān)（r= 0.8264，P＜0.05；r=0.8483，P＜0.05），全血PAI-1水平與腎組織nephrin蛋白的表達變化呈現(xiàn)負相關(guān)（r= -0.8152，P＜0.05）。全血tPA和uPA、PAI-1水平與腎組織WT1蛋白的表達變化則無明顯相關(guān)（r1= 0.2372，r2=0.2531，r3=0.2483；均P＞0.05）。

表2 4周末各組腎組織nephrin、WT1的表達（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

表2 4周末各組腎組織nephrin、WT1的表達（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

注：模型組與正常組比較，*P＜0.05；模型組與干預(yù)組相比，#P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

組別Groups　Nephrin　WT1正常組Normal　12.35±3.78　25.45±11.37模型組Model　5.62±2.03*#　22.60±14.16干預(yù)組Intervention　12.06±4.23　25.14±6.25

圖3 4周末兩組腎組織nephrin、WT1的表達情況Fig.3 Expression of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

3 討論

MN是一種常見的腎小球疾病，是成人腎病綜合征最常見的病因，在原發(fā)性腎小球疾病導(dǎo)致的終末期腎病中是第二位或第三位的常見原因。其主要的病理改變是腎小球基底膜上皮下免疫復(fù)合物沉積伴GBM彌漫性增厚，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿或者腎病綜合征，常有髙凝狀態(tài)存在，腎小球硬化、纖維化為各型腎小球疾病終末階段所常見［1］。纖溶系統(tǒng)在膜性腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。作為纖溶系統(tǒng)中重要的活性物質(zhì)，tPA和uPA均能激活纖溶酶原，也是人類血液中僅有的兩種纖溶酶原激活物，與uPA相比，tPA結(jié)構(gòu)上的賴氨酸結(jié)合部位使其可特異性結(jié)合于纖維蛋白血凝塊上，進而增加了溶血功能。uPA在各組織中廣泛存在，尤其常見于結(jié)締組織或細胞外組織，可局部活化細胞外間質(zhì)中的纖溶酶原，形成纖溶酶進而降解大多數(shù)糖蛋白［3］。

PAI-1（纖溶酶原激活物抑制劑-1）是一種單鏈糖蛋白，相對分子質(zhì)量52×103，含379個氨基酸，屬絲氨酸蛋白酶抑制物家族［5］。其主要作用是通過與PA形成不可逆的復(fù)合物而滅活tPA（組織型纖溶酶原激活物）的活性，而在病理條件下高表達的PAI-1還能滅活uPA（尿激酶型纖溶酶原激活物）的活性，從而使纖維蛋白因無法降解而在組織中沉積下來，并導(dǎo)致細胞外基質(zhì)合成增加、降解抑制，進而導(dǎo)致組織纖維化［5］。

本實驗研究結(jié)果顯示，從第二周末起，與正常組及干預(yù)組相比，模型組膜性腎病大鼠的血清tPA和uPA水平出現(xiàn)明顯下降，而PAI-1水平則明顯上升；相關(guān)性分析及各組細胞損傷及調(diào)亡的差異提示早期預(yù)防纖溶紊亂對防止MN進展有重要意義。

膜性腎病的一個重要特征是足細胞損傷。足細胞在膜性腎病病理狀態(tài)各種損傷因素作用下可能發(fā)生若干足細胞特異蛋白分子（nephrin、WT-1等）表達的下調(diào)以及形態(tài)學(xué)變化，如細胞凋亡等［6］。作為一種高度分化成熟的細胞，足細胞的分裂增殖能力不強，因此足細胞的減少和丟失可作為反映腎小球損傷嚴重程度和腎硬化進展的重要觀測指標(biāo)及預(yù)測指標(biāo)。Nephrin是近幾年來在足細胞裂孔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個跨膜糖蛋白，它特異地表達在足細胞的裂孔膜上，對于維持正常的腎小球濾過功能具有重大意義［7］。有研究發(fā)現(xiàn)nephrin參與足細胞的重要功能，目前多數(shù)研究者認為nephrin的減少與蛋白尿的發(fā)生關(guān)系密切［7-8］。足細胞特異性蛋白WTl（Wilms Tumor-1）是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子，定位于表達在足細胞核，它是足細胞特異性標(biāo)志之一［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)在局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）中，WTl表達下降［11］，本實驗免疫組化實驗結(jié)果顯示，MN模型大鼠中nephrin和WT1蛋白的表達均明顯減少，而nephrin蛋白表達的下調(diào)更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與足細胞相對數(shù)目和密度的逐漸下調(diào)呈正相關(guān)關(guān)系，而干預(yù)組nephrin和WT1蛋白表達水平及足細胞數(shù)目及密度均較正常組無明顯差異，相關(guān)性分析提示nephrin和 WT1蛋白的表達在維持足細胞數(shù)量中可能起重要作用，而足細胞nephrin和WTl蛋白表達的減少或可作為足細胞凋亡的標(biāo)志，進而作為反映腎小球損傷嚴重程度和腎硬化進展的重要觀測指標(biāo)及預(yù)測指標(biāo)。

綜上，在大鼠MN模型構(gòu)建的早期（第一周）即檢測到纖溶系統(tǒng)的重要組成物質(zhì)tPA、uPA的明顯下調(diào)而PAI-1表達則明顯上調(diào)，這與足細胞nephrin 和WTl蛋白表達下調(diào)，足細胞凋亡加劇等趨勢保持一致，干預(yù)治療及相關(guān)性分析提示早期通過監(jiān)測血漿中纖溶系統(tǒng)動態(tài)變化初步估計足細胞損傷凋亡情況是可行的，本研究從分子水平揭示MN從蛋白尿到足細胞損害腎小球硬化的發(fā)病機制。

參考文獻

［1］ Wang J，Zhu P，Cui Z，et al.Clinical features and outcomes in patients with membranous nephropathy and crescent formation ［J］.Medicine（Baltimore），2015，94（50）：e2294.

［2］ Kunamneni A，Durvasula R.Streptokinase-A drug for thrombolytic therapy：a patent review［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2014，9（2）：106-121.

［3］ 張燕.膜性腎病大鼠足細胞轉(zhuǎn)分化情況及川芎嗪對其影響的實驗研究［D］.瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院，2011：15-17.

［4］ Meyer-Schwesinger C，Meyer TN，Sievert H，et al.Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 activity induces polyubiquitin accumulation in podocytes and increases proteinuria in rat membranous nephropathy［J］.Am J Pathol，2011，178（5）：2044-2057.

［5］ Treweeke AT，Maskrey BH，Hickson K，et al.Iodixanol has a favourable fibrinolytic profile compared to iohexol in cardiac patients undergoing elective angiography：A double-blind，randomized，parallel group study［J］.PLoS One，2016，11（1）：e0147196.

［6］ PLOS ONE Staff.Correction：Endocytosed β2-microglobulin amyloid fibrils induce necrosis and apoptosis of rabbit synovial fibroblasts by disrupting endosomal/lysosomal membranes：A novel mechanism on the cytotoxicity of amyloid fibrils［J］.PLoS One，2015，0141631.

［7］ 楊維娜，任淑婷，錢亦華，等.阿霉素腎病大鼠腎小球中足細胞數(shù)量及nephrin、VEGF的表達變化 ［J］.四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，41（3）：458-463.

［8］ 李秋月，李六生，李桂霞，等.坎地沙坦對糖尿病腎病大鼠足細胞Nephrin、Podocin和CD2AP表達的影響 ［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，41（3）：310-314.

［9］ Sangkhathat S，Maneechay W，Chaiyapan W，et al.Association of Wilms’tumor 1 gene single-nucleotide polymorphism rs16754 with colorectal cancer［J］.Mol Clin Oncol，2015，3（6）：1401-1405.

［10］ Shimodaira S，Sano K，Hirabayashi K，et al.Dendritic cellbased adjuvant vaccination targeting Wilms’Tumor 1 in patients with advanced colorectal cancer［J］.Vaccines（Basel），2015，3（4）：1004-1018.

［11］ Iijima K，Someya T，Ito S，et al.Focal segmental glomerulosclerosis in patients with complete deletion of one WT1 allele［J］. Pediatrics，2012，129（6）：e1621-5.

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0283-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.013

［基金項目］四川省衛(wèi)生廳科研課題（編號：110238）。

［作者簡介］梁靜（1981-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腎臟纖維化相關(guān)疾病的研究。Email：liangjing9743@163.com。

［通訊作者］王莉（1962-），女，博士，主任醫(yī)師，從事各種腎臟疾病的診斷治療及血液透析、腹膜透析技術(shù)的研究。Email：scwangli62@ 163.com。of early phase of MN podocyte injury may be another therapy target for prevention of the disease development，and then provide new ideas for clinical research and drug development for MN.

Corresponding author：WANG Li，Email：scwangli62@163.com

［收稿日期］2016-02-23

Effect of fibrinolytic system on the podocyte injury in rats with membranous nephropathy

LIANG Jing1，ZHANG Yuan2，CAO Ling3，MENG Xiang-long1，WANG Li2*
（1.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital East Branch，Chengdu 610110，China；2.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072；3.Department of Nephrology，Affiliated Hospital to Luzhou Medical College，Luzhou 646000）

【Abstract】Objective To observe the expression of uPA，tPA and PAI-1 in whole blood of rat membranous nephropathy（MN）models induced by cationic bovine serum albumin（C-BSA），and to explore the effect of fibrinolytic system on podocyte apoptosis and pathological changes.To explore the possible preventive and therapeutic effects and the possible mechanisms of early prevention of fibrinolysis.Methods We developed a MN model with the modified Border method.At the end of the 1st，2nd，3th，and 4th week of immunization，respectively，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 were determined by ELISA.The rat kidney tissues were examined by light microscopy and electron microscopy to identify the pathological changes.The expression levels of nephrin and WTl were detected with immumofluorescence staining and their correlation was analyzed.Results Compared the treatment group with control group，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 of the model group were decreased，while PAI-1 was elevated，showing a significant difference（P＜0.05）.The degree of renal interstitial fibrosis was more serious.Correlation analysis showed that the whole blood tPA and uPA levels were positively correlated with the changes of nephrin protein expression in the kidney tissue，while the whole blood PAI-1 level was negatively correlated with the nephrin protein expression in the kidney tissue.Conclusions In the process of MN development，the fibrinolytic system may have important significance for podocyte apoptosis.Determination

【Key words】Kidney；Membranous nephropathy；Podocyte；Nephrin；WT-1；Fibrinolytic system；Rats；Pathology