梁靜，張淵2，曹靈3，孟祥龍，王莉2*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腎臟科，成都 610110；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟科，成都 610072；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000）

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纖溶系統(tǒng)對(duì)膜性腎病大鼠足細(xì)胞損傷的影響

梁靜1，張淵2，曹靈3，孟祥龍1，王莉2*

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腎臟科，成都 610110；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟科，成都 610072；3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000）

【摘要】目的 探討早期預(yù)防纖溶紊亂對(duì)防止MN進(jìn)展有重要意義。方法 按改良Border法制作MN大鼠模型，正式免疫第1、2、3、4周末檢測(cè)全血uPA、tPA及PAI-1的表達(dá)水平；取大鼠腎組織進(jìn)行光鏡、電鏡觀察腎組織病理學(xué)改變；采用免疫組化方法檢測(cè)腎足細(xì)胞nephrin、WTl蛋白表達(dá)含量，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 與正常組及干預(yù)組大鼠相比，模型組大鼠的全血uPA、tPA水平明顯減少，而PAI-1水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電鏡顯示腎小球足細(xì)胞廣泛足突融合至消失；GBM基質(zhì)出現(xiàn)“釘樣突起”，腎間質(zhì)纖維化程度較重。腎小球足細(xì)胞分布區(qū)WT-1和nephrin蛋白表達(dá)下調(diào)，其中nephrin蛋白表達(dá)量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，大鼠全血tPA和uPA水平與腎組織nephrin蛋白的表達(dá)變化呈正相關(guān)，全血PAI-1水平與腎組織nephrin蛋白的表達(dá)變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。結(jié)論 在MN發(fā)展中，纖溶系統(tǒng)對(duì)足細(xì)胞損傷凋亡具有重要意義，早期評(píng)估預(yù)測(cè)MN足細(xì)胞損傷情況或可為防治早期MN步入終末期腎臟病找到又一治療靶點(diǎn)，亦可為臨床研究治療MN的藥物提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】膜性腎??；足細(xì)胞；Nephrin；WT-1；纖溶系統(tǒng)

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種非炎癥性腎小球疾病，表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡而導(dǎo)致的腎小球基底膜普遍增厚及腎小球硬化。纖溶系統(tǒng)在膜性腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［1］。作為纖溶系統(tǒng)中重要的活性物質(zhì)，血漿中組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）及其抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）之間的動(dòng)態(tài)平衡，尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）等物質(zhì)對(duì)維持微血管的正常生理功能起重要作用［2］。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠膜性腎病模型，對(duì)膜性腎病血清uPA、tPA、PAI-1的變化情況及其對(duì)足細(xì)胞損傷凋亡的影響及腎臟病理的影響進(jìn)行了探討，旨在為臨床預(yù)測(cè)MN足細(xì)胞損傷及預(yù)后提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

兔抗大鼠nephrin抗體、兔抗大鼠WT1多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司；陽(yáng)離子化牛血清蛋白（C-BSA）購(gòu)自Chondrex公司；低分子肝素速碧林購(gòu)自杭州寒諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司；大鼠uPA ELISA試劑盒購(gòu)自Elabscience公司；大鼠tPA ELISA試劑盒購(gòu)自 Elabscience公司；大鼠 PAI-1 ELISA試劑盒購(gòu)自Elabscience公司。

1.1.2 動(dòng)物及分組

由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供雄性、清潔級(jí)SD大鼠30只，體重為（200±20）g，動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境7 d，將尿蛋白為陰性者隨機(jī)分為正常組和模型組，正常組10只；模型組10只；干預(yù)組10只。

1.2 方法

1.2.1 C-BSA腎炎模型制作

采用改良版Border法［3］，取C-BSA 1mL溶解于0.5 mL生理鹽水中，與等量不完全弗氏佐劑充分乳化，在大鼠頸背部，腹股溝等皮下多點(diǎn)注射，1周后通過(guò)連續(xù)4周隔日尾靜脈注射C-BSA（16 mg/kg）制作大鼠膜性腎病模型作為模型組，正常組隔日尾靜脈注射1 mL生理鹽水（NS）代替C-BSA。干預(yù)組參照說(shuō)明書(shū)及相關(guān)文獻(xiàn)［3］每日分兩次皮下注射給予低分子肝素治療，確定劑量為450 U/kg。模型組及正常對(duì)照組每日兩次皮下注射給予同等劑量的生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本收集

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4周末各取4只用頸動(dòng)脈托管法取血各6 mL后4℃離心分離血清，-20℃冰箱保存以供測(cè)定血清uPa、tPa、PAI-1；第4周末對(duì)各組大鼠殺檢，腎臟取下后剝離腎包膜，取一部分腎組織迅速置于液氮，之后轉(zhuǎn)入-80℃保存；其余腎組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟制成3 μm切片備用。

1.2.3 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)

取部分腎臟石蠟切片，分別進(jìn)行PASM染色、Masson染色［4］，高倍光鏡及電鏡下觀察大鼠腎組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 腎臟組織病理學(xué)圖像分析

使用Meta Morph圖像分析系統(tǒng)在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野測(cè)定每組PASM染色切片的腎小球系膜陽(yáng)性目標(biāo)吸光度（A）。使用 HMIAS-2000高清晰彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)在400倍光鏡下選取10個(gè)皮質(zhì)視野進(jìn)行拍照，取平均值計(jì)算纖維化面積占整個(gè)視野間質(zhì)面積（腎小球、腎小管及血管面積不計(jì)算在內(nèi)）的比值。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢查

采用SP法，石蠟包埋的切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2阻斷清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；正常山羊血清封閉液30℃恒溫封閉30 min，分別用抗體效價(jià)為1∶100 μL的兔抗大鼠nephrin、WT1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的抗兔抗體（原液），30℃孵育40 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（原液），30℃孵育40 min；最后加DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕褐色顆粒為陽(yáng)性，采用GD-8病理彩色圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.6 ELISA

血清uPa、tPa、PAI-1的檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 for Windows軟件包統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。相關(guān)性分析采用線(xiàn)性分析法。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)變化

與正常組相比，模型組血清uPa和tPa水平明顯下降，PAI-1顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間比較，模型組血清uPa從第1周開(kāi)始顯著低于正常組，血清tPa水平從第2周開(kāi)始顯著低于正常組，血清PAI-1從第2周開(kāi)始顯著高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝素干預(yù)組一般指標(biāo)與正常組相似，從第二周開(kāi)始，模型組較干預(yù)組各指標(biāo)差異有顯著性（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 模型組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下可見(jiàn)正常組腎組織病理學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)異常；干預(yù)組大鼠腎組織病理學(xué)檢測(cè)亦未見(jiàn)明顯異常；模型組HE染色可見(jiàn)腎小球明顯腫大，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)纖維化程度嚴(yán)重；Masson染色結(jié)果顯示嗜復(fù)紅蛋白有明顯沉積；PASM染色顯示GBM、TBM顯示彌漫性增厚，出現(xiàn)“梯狀”外觀。電鏡觀察顯示正常組腎組織超微結(jié)構(gòu)正常；模型組腎組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p害，腎小球上皮下可見(jiàn)電子致密物沉積，“釘突”明顯可見(jiàn)，腎小球足細(xì)胞廣泛足突融合甚至消失。見(jiàn)圖1、2。

表1 各組大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比較（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

表1 各組大鼠血清uPa、tPa、PAI-1水平的比較（±s，ng/mL）Tab.1 Comparison of serum levels of uPa，tPa，and PAI-1 in the rats

注：*與正常組相比，P＜0.05；#與干預(yù)組相比，P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

指標(biāo)Indexes干預(yù)組Intervention group uPa　1　1.13±0.06　0.86±0.04*　1.05±0.03 2 1.14±0.08　0.71±0.03*#　1.06±0.04 3 1.07±0.02　0.62±0.01*#　1.01±0.06 4 1.03±0.05　0.55±0.01*#　0.92±0.12 tPa　1　2.87±0.12　2.58±0.09　2.83±0.21 2 2.67±0.11　2.36±0.04*#　2.62±0.09 3 2.91±0.07　1.92±0.07*#　2.81±0.13 4 2.83±0.16　1.70±0.08*#　2.61±0.06 PAI-1　1　21.85±2.14　22.69±1.53　21.87±3.13 2 20.64±1.46　23.24±1.08*#　20.94±1.47 3 20.69±1.38　26.51±1.14*#　21.74±1.95 4 22.47±0.42　29.62±1.95*#　22.83±0.85 周Weeks正常組Normal group模型組Model group

2.3 大鼠腎間質(zhì)纖維化面積

模型組腎組織的纖維化面積為（28.21± 11.53）%，正常組為（12.63±5.42）%，干預(yù)組為（13.12±3.51）%；與正常組相比，模型組面積更大，差異有顯著性（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，大鼠全血tPA和uPA水平與腎間質(zhì)纖維化面積呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.8654，P＜0.05；r=-0.8243，P ＜0.05），全血PAI-1水平與腎間質(zhì)纖維化面積呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.8324，P＜0.05）。

圖1 大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化×400；HE染色Fig.1 Pathological changes in the rat kidney tissues HE staining×400

注：從左到右依次為Masson染色（×400）、PASM染色（×400）、電鏡（×20 000）。圖2腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察Note.Pathological changes of the rat kidneys.Masson staining，×400；PASM staining，×400；Electron microscopy，×20 000.Fig.2 Pathological observation of the kidney tissues

2.4 腎組織WT1蛋白和nephrin蛋白的表達(dá)變化

正常組腎組織切片中可見(jiàn)nephrin呈淺棕色染色沿腎小球毛細(xì)血管襻呈均勻、線(xiàn)狀分布，腎小管有少量分布；干預(yù)組亦未見(jiàn)明顯異常；模型組4周時(shí)nephrin表達(dá)較正常組顯著減少，表達(dá)不均，稀疏，部分區(qū)域表達(dá)消失，較正常組及模型組差異有顯著性（P＜0.01），WT1于MN4周末時(shí)在足細(xì)胞核的表達(dá)呈深棕色粗大顆粒，與正常組及干預(yù)組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）（見(jiàn)表2、圖3）。

2.5 腎組織Nephrin蛋白、WT1蛋白與全血tPA、uPA、PAI-1相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，模型組大鼠全血tPA和uPA水平與腎組織Nephrin蛋白的表達(dá)變化呈正相關(guān)（r= 0.8264，P＜0.05；r=0.8483，P＜0.05），全血PAI-1水平與腎組織nephrin蛋白的表達(dá)變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r= -0.8152，P＜0.05）。全血tPA和uPA、PAI-1水平與腎組織WT1蛋白的表達(dá)變化則無(wú)明顯相關(guān)（r1= 0.2372，r2=0.2531，r3=0.2483；均P＞0.05）。

表2 4周末各組腎組織nephrin、WT1的表達(dá)（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

表2 4周末各組腎組織nephrin、WT1的表達(dá)（±s，n=10）Tab.2 Expression level of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

注：模型組與正常組比較，*P＜0.05；模型組與干預(yù)組相比，#P＜0.05。Note.Compared with the normal group，*P＜0.05；Compared with the intervention group，#P＜0.05.

組別Groups　Nephrin　WT1正常組Normal　12.35±3.78　25.45±11.37模型組Model　5.62±2.03*#　22.60±14.16干預(yù)組Intervention　12.06±4.23　25.14±6.25

圖3 4周末兩組腎組織nephrin、WT1的表達(dá)情況Fig.3 Expression of nephrin and WT1 in the kidney tissues at the end of 4thweek

3 討論

MN是一種常見(jiàn)的腎小球疾病，是成人腎病綜合征最常見(jiàn)的病因，在原發(fā)性腎小球疾病導(dǎo)致的終末期腎病中是第二位或第三位的常見(jiàn)原因。其主要的病理改變是腎小球基底膜上皮下免疫復(fù)合物沉積伴GBM彌漫性增厚，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿或者腎病綜合征，常有髙凝狀態(tài)存在，腎小球硬化、纖維化為各型腎小球疾病終末階段所常見(jiàn)［1］。纖溶系統(tǒng)在膜性腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。作為纖溶系統(tǒng)中重要的活性物質(zhì)，tPA和uPA均能激活纖溶酶原，也是人類(lèi)血液中僅有的兩種纖溶酶原激活物，與uPA相比，tPA結(jié)構(gòu)上的賴(lài)氨酸結(jié)合部位使其可特異性結(jié)合于纖維蛋白血凝塊上，進(jìn)而增加了溶血功能。uPA在各組織中廣泛存在，尤其常見(jiàn)于結(jié)締組織或細(xì)胞外組織，可局部活化細(xì)胞外間質(zhì)中的纖溶酶原，形成纖溶酶進(jìn)而降解大多數(shù)糖蛋白［3］。

PAI-1（纖溶酶原激活物抑制劑-1）是一種單鏈糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量52×103，含379個(gè)氨基酸，屬絲氨酸蛋白酶抑制物家族［5］。其主要作用是通過(guò)與PA形成不可逆的復(fù)合物而滅活tPA（組織型纖溶酶原激活物）的活性，而在病理?xiàng)l件下高表達(dá)的PAI-1還能滅活uPA（尿激酶型纖溶酶原激活物）的活性，從而使纖維蛋白因無(wú)法降解而在組織中沉積下來(lái)，并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、降解抑制，進(jìn)而導(dǎo)致組織纖維化［5］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，從第二周末起，與正常組及干預(yù)組相比，模型組膜性腎病大鼠的血清tPA和uPA水平出現(xiàn)明顯下降，而PAI-1水平則明顯上升；相關(guān)性分析及各組細(xì)胞損傷及調(diào)亡的差異提示早期預(yù)防纖溶紊亂對(duì)防止MN進(jìn)展有重要意義。

膜性腎病的一個(gè)重要特征是足細(xì)胞損傷。足細(xì)胞在膜性腎病病理狀態(tài)各種損傷因素作用下可能發(fā)生若干足細(xì)胞特異蛋白分子（nephrin、WT-1等）表達(dá)的下調(diào)以及形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞凋亡等［6］。作為一種高度分化成熟的細(xì)胞，足細(xì)胞的分裂增殖能力不強(qiáng)，因此足細(xì)胞的減少和丟失可作為反映腎小球損傷嚴(yán)重程度和腎硬化進(jìn)展的重要觀測(cè)指標(biāo)及預(yù)測(cè)指標(biāo)。Nephrin是近幾年來(lái)在足細(xì)胞裂孔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)跨膜糖蛋白，它特異地表達(dá)在足細(xì)胞的裂孔膜上，對(duì)于維持正常的腎小球?yàn)V過(guò)功能具有重大意義［7］。有研究發(fā)現(xiàn)nephrin參與足細(xì)胞的重要功能，目前多數(shù)研究者認(rèn)為nephrin的減少與蛋白尿的發(fā)生關(guān)系密切［7-8］。足細(xì)胞特異性蛋白WTl（Wilms Tumor-1）是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子，定位于表達(dá)在足細(xì)胞核，它是足細(xì)胞特異性標(biāo)志之一［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)在局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）中，WTl表達(dá)下降［11］，本實(shí)驗(yàn)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MN模型大鼠中nephrin和WT1蛋白的表達(dá)均明顯減少，而nephrin蛋白表達(dá)的下調(diào)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與足細(xì)胞相對(duì)數(shù)目和密度的逐漸下調(diào)呈正相關(guān)關(guān)系，而干預(yù)組nephrin和WT1蛋白表達(dá)水平及足細(xì)胞數(shù)目及密度均較正常組無(wú)明顯差異，相關(guān)性分析提示nephrin和 WT1蛋白的表達(dá)在維持足細(xì)胞數(shù)量中可能起重要作用，而足細(xì)胞nephrin和WTl蛋白表達(dá)的減少或可作為足細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，進(jìn)而作為反映腎小球損傷嚴(yán)重程度和腎硬化進(jìn)展的重要觀測(cè)指標(biāo)及預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上，在大鼠MN模型構(gòu)建的早期（第一周）即檢測(cè)到纖溶系統(tǒng)的重要組成物質(zhì)tPA、uPA的明顯下調(diào)而PAI-1表達(dá)則明顯上調(diào)，這與足細(xì)胞nephrin 和WTl蛋白表達(dá)下調(diào)，足細(xì)胞凋亡加劇等趨勢(shì)保持一致，干預(yù)治療及相關(guān)性分析提示早期通過(guò)監(jiān)測(cè)血漿中纖溶系統(tǒng)動(dòng)態(tài)變化初步估計(jì)足細(xì)胞損傷凋亡情況是可行的，本研究從分子水平揭示MN從蛋白尿到足細(xì)胞損害腎小球硬化的發(fā)病機(jī)制。

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【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）03-0283-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.013

［基金項(xiàng)目］四川省衛(wèi)生廳科研課題（編號(hào)：110238）。

［作者簡(jiǎn)介］梁靜（1981-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腎臟纖維化相關(guān)疾病的研究。Email：liangjing9743@163.com。

［通訊作者］王莉（1962-），女，博士，主任醫(yī)師，從事各種腎臟疾病的診斷治療及血液透析、腹膜透析技術(shù)的研究。Email：scwangli62@ 163.com。of early phase of MN podocyte injury may be another therapy target for prevention of the disease development，and then provide new ideas for clinical research and drug development for MN.

Corresponding author：WANG Li，Email：scwangli62@163.com

［收稿日期］2016-02-23

Effect of fibrinolytic system on the podocyte injury in rats with membranous nephropathy

LIANG Jing1，ZHANG Yuan2，CAO Ling3，MENG Xiang-long1，WANG Li2*
（1.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital East Branch，Chengdu 610110，China；2.Department of Nephrology，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072；3.Department of Nephrology，Affiliated Hospital to Luzhou Medical College，Luzhou 646000）

【Abstract】Objective To observe the expression of uPA，tPA and PAI-1 in whole blood of rat membranous nephropathy（MN）models induced by cationic bovine serum albumin（C-BSA），and to explore the effect of fibrinolytic system on podocyte apoptosis and pathological changes.To explore the possible preventive and therapeutic effects and the possible mechanisms of early prevention of fibrinolysis.Methods We developed a MN model with the modified Border method.At the end of the 1st，2nd，3th，and 4th week of immunization，respectively，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 were determined by ELISA.The rat kidney tissues were examined by light microscopy and electron microscopy to identify the pathological changes.The expression levels of nephrin and WTl were detected with immumofluorescence staining and their correlation was analyzed.Results Compared the treatment group with control group，the levels of whole blood uPA，tPA and PAI-1 of the model group were decreased，while PAI-1 was elevated，showing a significant difference（P＜0.05）.The degree of renal interstitial fibrosis was more serious.Correlation analysis showed that the whole blood tPA and uPA levels were positively correlated with the changes of nephrin protein expression in the kidney tissue，while the whole blood PAI-1 level was negatively correlated with the nephrin protein expression in the kidney tissue.Conclusions In the process of MN development，the fibrinolytic system may have important significance for podocyte apoptosis.Determination

【Key words】Kidney；Membranous nephropathy；Podocyte；Nephrin；WT-1；Fibrinolytic system；Rats；Pathology