祝明皓，陸濤峰2，牛銀杰2，趙麗麗2，陳洪巖2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

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專題研究

巴馬豬NK細(xì)胞表型鑒定及豬CIK細(xì)胞誘導(dǎo)方法建立

祝明皓1，2，陸濤峰2，牛銀杰2，趙麗麗2，陳洪巖2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

【摘要】目的 獲得巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的表型及比例的數(shù)據(jù)，建立一種高效率豬CIK（cytokine-induced killer）細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法。方法 分離巴馬小型豬外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)CD2+/CD8+/ CD3-細(xì)胞以表征豬NK細(xì)胞的表型；通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，提高誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中CIK的比例，建立高效率CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)方法。結(jié)果 利用優(yōu)化的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天時(shí)CD3-/CD2+/CD8+的NK細(xì)胞的比例可高達(dá)43.63%，較最初分離時(shí)NK細(xì)胞比例提升了5.59倍；細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天時(shí)可見明顯的3個(gè)熒光峰，表明誘導(dǎo)后細(xì)胞發(fā)生了3次分裂，理論上較最初分離增加了8倍；誘導(dǎo)細(xì)胞的qPCR表型分析表明該細(xì)胞群體在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天時(shí)相關(guān)的表面標(biāo)志有明顯的上升也與流式分析結(jié)果一致。結(jié)論 建立了高效的豬CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法。

【關(guān)鍵詞】巴馬小型豬；NK細(xì)胞；CIK細(xì)胞；表型鑒定

NK細(xì)胞，即自然殺傷細(xì)胞，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有殺傷性強(qiáng)、殺傷效果高效、可直接殺死癌細(xì)胞等特點(diǎn)，NK細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞和寄生蟲等［1］。NK細(xì)胞現(xiàn)已被越來(lái)越多地應(yīng)用于各種臨床研究之中，尤其是對(duì)人類及嚙齒類的研究較為透徹。但某些大型動(dòng)物如豬、牛等，其細(xì)胞表征與嚙齒類相比差異很大［5］，目前臨床研究也相對(duì)較少，因此能建立一種能夠高效地分離豬NK細(xì)胞并使其能在體外穩(wěn)定增殖的方法便尤為方便重要。

通過(guò)細(xì)胞因子而誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)的方法在近些年中已有大量報(bào)道，而目前人的CIK細(xì)胞已研發(fā)成功并投入到臨床應(yīng)用。該細(xì)胞的培養(yǎng)方法是通過(guò)在無(wú)血清的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別在不同培養(yǎng)時(shí)期加入CD3、IFN-γ以及IL-2等細(xì)胞因子，以達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞殺傷性、促進(jìn)細(xì)胞體外增殖的目的［2-5］。根據(jù)已有報(bào)道，通過(guò)該方法培養(yǎng)的殺傷細(xì)胞可在體外連續(xù)培養(yǎng)20 d左右，增殖約15代左右，是在短時(shí)間內(nèi)大量獲得殺傷性細(xì)胞的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)豬NK細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)并進(jìn)一步對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高NK細(xì)胞比例。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)CD2+/CD8+/CD3-表型的豬NK細(xì)胞的數(shù)量比例進(jìn)行流式檢測(cè)［6］。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每天對(duì)細(xì)胞留樣并提取RNA，并根據(jù)Talker 與Gerner的研究方法［7，8］，對(duì)各個(gè)時(shí)期豬CIK細(xì)胞的CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA和PRF1這五種表面標(biāo)志用熒光定量RT-PCR的方法進(jìn)行表型鑒定［8］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自于 Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自于Gibco公司，KBM581培養(yǎng)液購(gòu)自于Corning公司，雙抗由本研究所提供。人CD3單抗由博士德生物提供，IFN-γ與IL-2誘導(dǎo)素購(gòu)自于雙鷺?biāo)帢I(yè)。Anti-CD2（Apc）抗體，Anti-CD3 （FITC）抗體，Anti-CD8（PE-cy5）抗體均購(gòu)自于Abcam公司。CFDA-SE熒光染料購(gòu)自于 KeyGen公司，TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒由Transgen公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬外周血淋巴細(xì)胞分離及表型鑒定

從頸靜脈采集巴馬小型豬血液，加入到含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管中。采用Percoll（1.110 ng/ L）密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞［9，10］，收集淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌2次，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，利用流式抗體CD2、CD3、CD8對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各種表面標(biāo)志的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)方法參照表型分析部分。。

1.2.2 細(xì)胞因子刺激及體外培養(yǎng)

在最初分離的外周血淋巴細(xì)胞按1000 U/mL的終濃度加入IFN-γ，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日按終濃度補(bǔ)加CD3 50 ng/mL和IL-2 1000 U/mL。每2～3 d觀察CIK細(xì)胞，并添加完全培養(yǎng)基和IL-2（終濃度1000 U/mL）［5，6］。培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)每天的細(xì)胞進(jìn)行一次200 μL的樣本留取，用于表面標(biāo)志的鑒定。為優(yōu)化培養(yǎng)條件，本實(shí)驗(yàn)選擇了KBM581無(wú)血清培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基+5%FBS進(jìn)行對(duì)比體外培養(yǎng)，以選取最合適的培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

將最初分離出的外周血淋巴細(xì)胞留取一部分，用CFDA-SE以1∶1000的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。加入熒光指示劑后37℃孵育30 min即可完成染色［7］。之后用PBS將細(xì)胞懸浮清洗兩次，離心條件同之前步驟，最后按照1.2.2方法進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞分別在1、3、5、7、9 d取適量細(xì)胞樣品，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)用1640和KBM581培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行染色，分別在相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)其增殖狀況進(jìn)行檢測(cè)，以便更直接準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞誘導(dǎo)增殖的最適培養(yǎng)體系。

1.2.4 細(xì)胞表型分析

（1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD2+/CD8+/CD3-細(xì)胞比例

在豬外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對(duì)細(xì)胞取樣，按照比例1∶100加入流式抗體CD2、CD3、CD8對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，每次標(biāo)記過(guò)程中都進(jìn)行四組染色標(biāo)記，分別為三種標(biāo)簽的單獨(dú)標(biāo)記及三種標(biāo)簽的共同標(biāo)記，標(biāo)記方法如下：首先吸取適量細(xì)胞培養(yǎng)液，600 g離心15 min，棄上清后用適量PBS懸浮清洗細(xì)胞，再次600 g離心15 min，之后用5%BSA懸浮細(xì)胞，室溫封閉1 h，按上述條件離心，加入適量PBS懸浮細(xì)胞，并根據(jù)需求加入不同抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，37℃孵育1 h后，離心，并用PBS清洗兩次，最后再用適量PBS重懸細(xì)胞，過(guò)300目細(xì)胞篩后將樣品轉(zhuǎn)移至流式管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表型為CD2+/CD8+/CD3-的NK細(xì)胞比例變化情況。

（2）熒光定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表型

首先以Talker等人研究報(bào)道為參考，在NCBI查獲要檢測(cè)的CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA和PRF1五種基因CDS序列，并合成引物，再以韓建強(qiáng)等［11］為參考，合成GAPDH單拷貝基因引物［8］，待合成出可擴(kuò)增出單一基因片段的全部引物后，以之前取得的1～9 d細(xì)胞樣品提取的RNA為模板，根據(jù)所購(gòu)買的試劑盒說(shuō)明書分別用上述引物進(jìn)行細(xì)胞表型的qRT-PCR檢測(cè)。每個(gè)基因表達(dá)量原始數(shù)據(jù)，經(jīng)處理后得到相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

CD2、CD3、CD8對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各種表面標(biāo)志的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所致。結(jié)果表明，新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞中，淋巴細(xì)胞約占總細(xì)胞含量的26.4%，淋巴細(xì)胞中CD2+細(xì)胞的比例約為 41.54%、CD3+細(xì)胞的比例約為26.89%、CD8+細(xì)胞的比例約為 34.83%，CD2+/ CD8+/CD3-細(xì)胞的比例約為 7.82%。CD2+/ CD8+/CD3-細(xì)胞被認(rèn)為是豬NK細(xì)胞的典型表型，因此，本研究中測(cè)得的巴馬豬NK細(xì)胞約占總淋巴細(xì)胞的7.82%。

2.1 巴馬豬NK細(xì)胞的表型分析

分離巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞，利用流式抗體

圖1 巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞表型分析Fig.1 Phenotype identification of PBMCs in the Bama miniature pigs

2.2 巴馬豬CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法的建立

2.2.1 培養(yǎng)體系優(yōu)化

將分離得到的淋巴細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，采用不同的培養(yǎng)體系，“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無(wú)血清培養(yǎng)液”，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行記錄，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)得到的細(xì)胞在前期培養(yǎng)過(guò)程中（1～6 d）在形態(tài)上差異不顯著（如圖2），但在體外培養(yǎng)的后期（7 d以后）KBM581培養(yǎng)的細(xì)胞的凋亡速度和細(xì)胞碎片數(shù)量明顯較1640培養(yǎng)多。

注：A.1640培養(yǎng)體系培養(yǎng)3 d；B.KBM581培養(yǎng)體系培養(yǎng)3 d。圖2 巴馬豬CIK細(xì)胞形態(tài)（×200）Note.A.Cells cultured in 1640 medium for 3 days. B.Cells cultured in KBM581 medium for 3 days.Fig.2 Morphology of cytokine-induced killer cells in the Bama miniature pigs（×200）

2.2.2 巴馬豬CIK細(xì)胞增殖

選擇同一批分離的外周血淋巴細(xì)胞，分別用“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無(wú)血清培養(yǎng)液”進(jìn)行培養(yǎng)，按照1.2.2的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的CIK細(xì)胞和按照1.2.3的方法用CDFA-SE標(biāo)記細(xì)胞，分別在培養(yǎng)的第1、3、5天進(jìn)行細(xì)胞取樣，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖情況（如圖3所示）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)體系得到結(jié)果基本一致，在誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天時(shí)均可見明顯的3個(gè)熒光峰，表明誘導(dǎo)后細(xì)胞發(fā)生了3次分裂，理論上較最初分離增加了8倍。

2.3 細(xì)胞表型分析

2.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD2+/CD8+/CD3-細(xì)胞比例變化

分離巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞，選擇1640培養(yǎng)體系進(jìn)行CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對(duì)細(xì)胞取樣，用CD2、CD3、CD8對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，利用流式細(xì)胞術(shù)分析豬CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的比例變化，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新鮮分離的淋巴細(xì)胞中具有NK細(xì)胞表型的細(xì)胞占7.81%，誘導(dǎo)培養(yǎng)第3天開始，CIK細(xì)胞比例明顯上升，到第5天達(dá)到頂峰，其占總細(xì)胞43.63%，較最初分離時(shí)相比細(xì)胞比例提升了5.59倍，繼續(xù)之后細(xì)胞比例趨于平穩(wěn)，在第7天之后NK細(xì)胞比例略有下降。

注：A～C分別為1640培養(yǎng)體系分別培養(yǎng)1、3、5 d用流式測(cè)得的細(xì)胞增殖結(jié)果；D～F分別為KBM581培養(yǎng)體系分別培養(yǎng)1、3、5 d用流式測(cè)得的細(xì)胞增殖結(jié)果。圖3 巴馬豬CIK細(xì)胞增殖活性分析Note.A-C：CIK cells cultured in 1640 medium for 1，3 and 5 days；D-F：CIK cells cultured in KBM581 medium for 1，3 and 5 days.Fig.3 Analysis of the proliferation activity of CIK cells in the Bama miniature pigs

注：A～E分別為CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間（1、3、5、7、9 d）具有NK細(xì)胞表型（CD2+/CD8+/CD3-）的細(xì)胞比例變化情況；F圖為CD2+/CD8+/CD3-細(xì)胞數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖4 巴馬豬CIK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程比例變化分析Note.A-E，Cultured in 1640 medium for 1，3，5，7 and 9 days；F：Statistical results of the CD2+/CD8+/CD3-cells.Fig.4 Changes of the ratio of CD2+/CD8+/CD3-cells of the Bama miniature pigs during the culture process

2.3.2 qRT-PCR檢測(cè)CIK細(xì)胞表型

分離巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞，選擇1640培養(yǎng)體系進(jìn)行CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9天對(duì)細(xì)胞取樣，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)豬NK細(xì)胞表面標(biāo)志CD2、CD3、CD8α、SLA-DRA 和PRF1五個(gè)基因的表達(dá)變化情況，統(tǒng)計(jì)各個(gè)基因與內(nèi)參的 Ct值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算2-ΔΔCt，繪制曲線，所檢測(cè)的數(shù)據(jù)在1～9 d變化結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)初期，由于誘導(dǎo)因子的加入，各NK細(xì)胞相關(guān)表型基因的表達(dá)量開始上升，在5 d達(dá)到頂峰，在6 d之后呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在第5天細(xì)胞群體有明顯增殖，各種表面marker表達(dá)都在此時(shí)增強(qiáng)，此結(jié)果與流式結(jié)果一致，表明在體外使用細(xì)胞因子誘導(dǎo)巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞能夠使具有NK細(xì)胞表型的細(xì)胞類群的比例明顯提高。

圖5 qRT-PCR檢測(cè)CIK細(xì)胞表型Fig.5 Phenotype analysis of the surface markers ofporcine NK cells detected by qRT-PCR

3 討論

本研究首先測(cè)定了新鮮分離的豬外周血淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞（CD2+/CD8+/CD3-）的比例，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，當(dāng)巴馬豬外周血淋巴細(xì)胞剛被分離出時(shí)，NK細(xì)胞約占總淋巴細(xì)胞的7.82%，本結(jié)果可以為豬NK細(xì)胞研究提供參考。

接下來(lái)，本研究比較了兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)效果，結(jié)果顯示“1640培養(yǎng)液+5%FBS”和“KBM581無(wú)血清培養(yǎng)液”兩種培養(yǎng)體系在培養(yǎng)7 d內(nèi)，在增殖活性和細(xì)胞表型上差異不顯著，但是在7 d之后，“1640培養(yǎng)液+5%FBS”的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞狀況要明顯好于“KBM581無(wú)血清培養(yǎng)液”體系的細(xì)胞，通過(guò)鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞形態(tài)均一程度便可較明顯的體現(xiàn)出來(lái)。兩種培養(yǎng)體系的主要差異在于培養(yǎng)體系中是否含有血清，因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩x擇不同的培養(yǎng)體系來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果。更重要的是本研究探索了一種無(wú)血清培養(yǎng)體系，對(duì)于利用該細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)條件的精細(xì)化控制具有探索性意義。

最后，通過(guò)對(duì)所分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞每天進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用我們建立的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法可以使豬外周血淋巴細(xì)胞中具有NK細(xì)胞表型的細(xì)胞數(shù)量在第5天時(shí)達(dá)到巔峰，占總淋巴細(xì)胞的43.63%，較最初分離時(shí)NK細(xì)胞比例提升了5.59倍，而淋巴細(xì)胞總體數(shù)量也增長(zhǎng)近8倍，因此，可利用此方法為體外細(xì)胞免疫試驗(yàn)提供足夠量的NK細(xì)胞表型的細(xì)胞。NK細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答中一類十分重要的淋巴細(xì)胞，可通過(guò)選擇性識(shí)別、殺傷低表達(dá)MHCI類分子的腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，有效地清除腫瘤進(jìn)而在機(jī)體抗腫瘤免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。靜止NK細(xì)胞具有一定的殺傷活性，若NK細(xì)胞的有效活化，可顯著增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究嘗試了一種體外顯著提高豬NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，可以為抗腫瘤免疫及其機(jī)制研究提供足夠量的效應(yīng)細(xì)胞，也可以為病原微生物引起的體外細(xì)胞免疫和免疫逃逸研究提供良好的研究思路。

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【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）03-0288-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.014

Corresponding author：CHEN Hong-yan，E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［基金項(xiàng)目］哈爾濱市科技平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2014QA3BN002）。

［作者簡(jiǎn)介］祝明皓（1990-），男，碩士研究生。研究方向：動(dòng)物學(xué)。E-mail：15804635767@139.com

［通訊作者］陳洪巖（1963-），男，研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［收稿日期］2016-02-23

Isolation，phenotype identification and activation of natural killer（NK）cells in Bama miniature pigs

ZHU Ming-hao1，2，LU Tao-feng2，NIU Yin-jie2，ZHAO Li-li2，CHEN Hong-yan2*
（1.Northeast Agricultural University，Harbin，150001，China；2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Harbin 150001，China）

【Abstract】Objective To describe the phenotype of NK cells in Bama miniature pigs，and establish an efficient activation and culture method for porcine cytokine-induced killer（CIK）cells in vitro.Methods The porcine peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）were isolated by Percoll gradient centrifugation，and the phenotype of NK cells was tested by detecting the CD2+/CD8+/CD3-cell compartment.To establish an efficient activation and culture method for porcine CIK cells，we optimized the culture conditions to improve the CIK activation efficiency.Results Using the optimized induction culture conditions，the ratio of CIK（CD2+/CD8+/CD3-）cells was up to 43.63%at the fifth day，approximately 5.59 times increased compared with the initially separated PBMCs.Cell proliferation experiments showed that three obvious fluorescence peaks were observed on the fifth day.The results indicated that the induced CIK cells underwent three times cell division，in theory，about increased 8-fold compared with the initial separation of PBMCs.Furthermore，the qRT-PCR result of the surface markers of porcine NK cells also showed a similar variation tendency as the flow cytometry results.Conclusions Our findings demonstrate the successful establishment of an efficient activation and culture method for porcine CIK cells in vitro.

【Key words】Bama miniature pig；Natural killer cells；Cytokine-induced killer cells；Phenotype identification